ประเมินความแม่นยำของ MMCA-PCR ในการตรวจ ยีนเบต้า-ธาลัสซีเมีย

ปุณชนิกา บุญเลิศ; ศุภเดช   ตันรัตนกุล

ผู้แต่ง

ปุณชนิกา บุญเลิศ ศูนย์อนามัยที่ 3 นครสวรรค์
ศุภเดช ตันรัตนกุล ศูนย์อนามัยที่ 3 นครสวรรค์

คำสำคัญ:

เบต้า-ธาลัสซีเมีย, MMCA-PCR, การกลายพันธุ์ของยีน, ความแม่นยำในการวินิจฉัย

บทคัดย่อ

เบต้า-ธาลัสซีเมียเป็นสาเหตุหนึ่งที่ทำให้เกิดโรคโลหิตจางทางพันธุกรรมที่มีความชุกสูงในประเทศไทยโดยพบอัตราพาหะประมาณร้อยละ 3–9 ของประชากร และพบฮีโมโกลบินอีร่วมด้วยในสัดส่วนสูง ส่งผลให้เกิดผู้ป่วยชนิดรุนแรง เช่น homozygous β-thalassemia และ β-thalassemia/Hb E ซึ่งเป็นภาระสำคัญต่อระบบสาธารณสุขของประเทศ การวินิจฉัยการกลายพันธุ์ของยีน β-globin อย่างถูกต้องและรวดเร็วมีบทบาทสำคัญต่อการคัดกรองคู่สมรสเสี่ยงและการวินิจฉัยก่อนคลอด ปัจจุบันวิธีมาตรฐาน ได้แก่ allele-specific PCR (AS-PCR) และ reverse dot-blot hybridization (RDB) แม้มีความแม่นยำสูง แต่มีข้อจำกัดด้านขั้นตอนการตรวจและความเสี่ยงต่อการปนเปื้อน

การศึกษานี้เป็น retrospective diagnostic accuracy study ภายใต้การปกปิดข้อมูลแบบ triple-blind design เพื่อประเมินประสิทธิภาพของชุดตรวจการกลายพันธุ์ยีน β-thalassemia ด้วยเทคนิค multicolor melting curve analysis polymerase chain reaction (MMCA-PCR) โดยเปรียบเทียบกับวิธีมาตรฐาน ตัวอย่างที่ใช้เป็นดีเอ็นเอคงเหลือจากการตรวจทางห้องปฏิบัติการ สกัดจากเลือดหญิงตั้งครรภ์และสามีที่ส่งตรวจจากโรงพยาบาลเครือข่ายเขตสุขภาพที่ 3 ในช่วงปี
พ.ศ. 2563–2568 จำนวน 146 ตัวอย่าง แบ่งเป็นผลบวกและผลลบอย่างละ 73 ตัวอย่าง ครอบคลุมการกลายพันธุ์ที่พบบ่อย ได้แก่ CD41/42 (-TTCT) 12 ตัวอย่าง, CD17 (A>T) 5 ตัวอย่าง, IVS-I-5 (G>C) 7 ตัวอย่าง, IVS-II-654 (C>T) 6 ตัวอย่าง, CD71/72 (+A) 10 ตัวอย่าง, CD26 (Hb E) 10 ตัวอย่าง รวมทั้งชนิดอื่น ๆ ได้แก่ IVS-I-1 (G>T), -28 (A>G), -31 (A>C), CD43 (GAG>TAG), CD30 (AGG>GGG), initiation codon mutation และ CD14-15 (+G)

ตัวอย่างทั้งหมดถูกเข้ารหัสแบบไม่ระบุตัวตนและแบ่งตรวจด้วย MMCA-PCR และวิธีอ้างอิงอย่างอิสระโดยผู้วิเคราะห์ไม่ทราบผลของกันและกัน การตรวจดำเนินการด้วยเครื่อง real-time PCR รุ่น SLAN-96S ร่วมกับชุดตรวจ β-thalassemia Genotyping Kit (MMCA-PCR) (Yaneng®) ผลการตรวจถูกวิเคราะห์ด้วยตาราง 2×2 เพื่อคำนวณค่าความไว ความจำเพาะ ค่าพยากรณ์ผลบวก ค่าพยากรณ์ผลลบ และความถูกต้อง พร้อมช่วงความเชื่อมั่นร้อยละ 95

ผลการศึกษาพบว่า MMCA-PCR ให้ผลสอดคล้องกับวิธีมาตรฐานครบทุกตัวอย่าง โดยตรวจพบการกลายพันธุ์ตรงกันทั้งชนิดและจำนวนตัวอย่าง คิดเป็นค่าความไว ความจำเพาะ และความถูกต้องร้อยละ 100 ไม่พบผลบวกลวงหรือผลลบลวง นอกจากนี้ระบบการตรวจแบบปิดยังช่วยลดความเสี่ยงการปนเปื้อนและลดระยะเวลาในการตรวจวิเคราะห์

สรุปได้ว่า MMCA-PCR มีประสิทธิภาพเทียบเท่าวิธีมาตรฐาน สามารถตรวจครอบคลุมการกลายพันธุ์ของยีน β-thalassemia ที่พบบ่อยในประชากรไทยได้อย่างแม่นยำ และมีศักยภาพในการประยุกต์ใช้เพื่อสนับสนุนการคัดกรองคู่สมรสเสี่ยงและการวินิจฉัยก่อนคลอด ซึ่งอาจช่วยลดการเกิดผู้ป่วยธาลัสซีเมีย ชนิดรุนแรงรายใหม่และสนับสนุนการควบคุมโรคในระดับประเทศได้อย่างมีประสิทธิภาพ

ประวัติผู้แต่ง

ปุณชนิกา บุญเลิศ, ศูนย์อนามัยที่ 3 นครสวรรค์

-

เอกสารอ้างอิง

กรมการแพทย์. แนวทางการดูแลรักษาผู้ป่วยธาลัสซีเมียในเวชปฏิบัติทั่วไป. นนทบุรี: สำนักวิชาการแพทย์ กรมการแพทย์; 2560.

กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์. คู่มือทางห้องปฏิบัติการการตรวจวินิจฉัยธาลัสซีเมียและฮีโมโกลบินผิดปกติ. พิมพ์ครั้งที่ 9. นนทบุรี: กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์; 2567.

Munkongdee T, Chen P, Winichagoon P, Fucharoen S, Paiboonsukwong K. Update in laboratory diagnosis of thalassemia. Front Mol Biosci. 2020;7:74.

Huang Q, Wang X, Tang N, Yan T, Chen P, Li Q. Simultaneous genotyping of α-thalassemia deletional and nondeletional mutations by real-time PCR-based multicolor melting curve analysis. J Mol Diagn. 2017;19(4):567-74.

Field A. Discovering statistics using IBM SPSS statistics. 5th ed. London: SAGE Publications; 2018.

Boonyawat B, Monsereenusorn C, Traivaree C. Molecular analysis of beta-globin gene mutations among Thai beta-thalassemia children: results from a single center study. Appl Clin Genet. 2014;7:253-8.

Sirichotiyakul S, Saetung R, Sanguansermsri T. Analysis of beta-thalassemia mutations in northern Thailand using automated fluorescence DNA sequencing. Hemoglobin. 2003;27(2):89-95.

ยุพิน โจ้แปง. สถานการณ์งานป้องกันและควบคุมโรคธาลัสซีเมีย เขตบริการสุขภาพที่ 9. นครราชสีมา: ศูนย์อนามัยที่ 9; 2566.

Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.

Buderer NM. Statistical methodology: I. Incorporating the prevalence of disease into the sample size calculation for sensitivity and specificity. Acad Emerg Med. 1996;3(9):895-900.