(บทความวิจัย) การประเมินกิจกรรมของเอนไซม์แอล-อะมิโนแอซิดออกซิเดสในพิษงู ด้วยวิธีพรัสเซียนบลูอะการ์: การทำให้บริสุทธิ์และการวิเคราะห์เอนไซม์จากพิษงูจงอาง
คำสำคัญ:
แอล-อะมิโนแอซิดออกซิเดส, พิษงูจงอาง , ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์, พรัสเซียนบลู, กลูตาไธโอนบทคัดย่อ
แอล-อะมิโนแอซิดออกซิเดส (L-amino acid oxidase; LAAO) เป็นเอนไซม์ในกลุ่มฟลาวินโปรตีนสามารถพบได้ในพิษงูหลายชนิด มีคุณสมบัติเป็นพิษต่อเซลล์และสามารถต้านจุลชีพได้ จากการสร้างไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาและประเมินวิธีพรัสเซียนบลูอะการ์ (Prussian blue agar; PBA) สำหรับการเกิดกิจกรรมของ LAAO ในพิษงูต่าง ๆ และทำให้เอนไซม์ดังกล่าวจากพิษงูจงอาง (Ophiophagus hannah) มีความบริสุทธิ์ ตลอดจนยืนยันเอกลักษณ์และลักษณะทางชีวเคมีของเอนไซม์ ผลจากการทดสอบพิษงู 5 ชนิด พบว่าพิษงูจงอางแสดงกิจกรรมของ LAAO สูงที่สุด โดยเกิดวงสีน้ำเงินเด่นชัดบนเพลต PBA ซึ่งเกิดจากปฏิกิริยาระหว่าง H2O2 และเฟอริไซยาไนด์จนเกิดผลึกพรัสเซียนบลู ขนาดของวงสีน้ำเงินมีความสัมพันธ์เชิงปริมาณกับความเข้มข้นมาตรฐานของ H2O2 จึงสามารถใช้ประเมินเชิงปริมาณได้ การเติมกลูตาไธโอนชนิดรีดิวซ์ (GSH) ส่งผลให้ขนาดวงสีน้ำเงินลดลงอย่างชัดเจน แสดงถึงฤทธิ์ต้านของ GSH ต่อกิจกรรมของ LAAO เอนไซม์ LAAO จากพิษงูจงอางผ่านการทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธีโครมาโทกราฟี และยืนยันโดย SDS-PAGE พร้อมหาลำดับกรดอะมิโนและการวิเคราะห์ด้วยโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงแบบ reverse phase (RP-HPLC) เพื่อแสดงตำแหน่งของ LAAO ที่เวลาประมาณ 80 นาที (retention time) วิธีการ PBA แสดงให้เห็นว่าเป็นวิธีที่รวดเร็ว ต้นทุนต่ำ เหมาะสำหรับการประเมินกิจกรรมของ LAAO มีความสำคัญสำหรับการวิจัยทางพิษวิทยา การวิเคราะห์คุณสมบัติเอนไซม์ และการศึกษาสารต่าง ๆ ในการยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์นี้
เอกสารอ้างอิง
Du XY, Clemetson KJ. Snake venom L-amino acid oxidases. Toxicon 2002; 40: 659-65.
Torii S, Naito M, Tsuruo T, Tsuchiya A. Apoxin I. A novel apoptosis-inducing factor with L-amino acid oxidase activity from Western diamondback rattlesnake venom. J Biol Chem 2000; 275: 4996-5002.
Sun LK, Jin Y, Liu S. L-amino acid oxidase induces apoptosis in human lung carcinoma cells. Acta Pharmacol Sin 2003; 24: 934-40.
Tan CH, Tan KY, Lim SE, Tan NH. Venomics of King Cobra (Ophiophagus hannah): A multi-omics approach to unravel the dynamic venom composition. J Proteomics 2015; 128: 121-31.
Tan KY, Tan CH. Venomics of Calliophis bivirgatus and comparative proteomic analysis of selected Elapid venom proteins. Toxins 2017; 9: 238.
Choudhury M, Conlon JM, Kini RM. Evolution of venom peptides in elapid snakes. Toxicon 2017; 138: 54-64.
Zhang L, Wei LJ, Zhang Y, et al. Purification and structural characterization of L-amino acid oxidase from Trimeresurus stejnegeri. Acta Biochim Biophys Sin 2004; 36: 310-6.
Stábeli RG, Marcussi S, Carlos GB, et al. Platelet aggregation and antibacterial effects of an LAAO from Bothrops alternatus venom. Biochimie 2004; 86: 21-8.
Xie C, Zeng L, Lu D, et al. Antibacterial effects of LAAO from King Cobra venom on pathogenic bacteria. Chin J Microbiol Immunol 2003; 23: 435-8.
Costa TR, Menaldo DL, Oliveira CZ, et al. Antitumor effects of snake venom L-amino acid oxidases: Perspectives for therapy. J Venom Anim Toxins Trop Dis 2014; 20: 23.
Salama WH, Ibrahim NM, El Hakim AE. Biological activity of L-amino acid oxidase from Cerastes cerastes venom. J Basic Clin Physiol Pharmacol 2018; 29: 511-9.
Izidoro LF, Sobrinho JC, Mendes MM, et al. Biochemical and functional characterization of an L-amino acid oxidase from Bothrops leucurus snake venom. Biochimie 2006; 88: 1253-65.
Fang H, Tong L, Xu X. A colorimetric method for hydrogen peroxide determination using Prussian blue formation. Talanta 2005; 65: 1281-6.
Malashkevich VN, Kameneva SV, Efremov RG, Shlyapnikov SV. Prussian blue formation reaction as a colorimetric assay for hydrogen peroxide in enzymatic reactions. Anal Biochem 1994; 220: 420-6.
Galaris D, Evangelou A. The role of oxidative stress in mechanisms of metal-induced carcinogenesis. Cancer Lett 2002; 123: 1-7.
Ng TS, Tan KY, Tan CH. Venomics approach reveals variation in venom composition of the King Cobra (Ophiophagus hannah) across its geographic range. J Proteomics 2019; 206: 103421.
Yu Z, Zhang Y, Zhang H, He L. Rapid and visual detection of hydrogen peroxide using a Prussian blue colorimetric agar plate. Anal Methods 2014; 6: 1231-6.
Singkham-In U, Thaveekarn W, Noiphrom J, et al. Hydrogen peroxide from L-amino acid oxidase of king cobra (Ophiophagus hannah) venom attenuates Pseudomonas biofilms. Sci Rep 2023; 13: 11304.
Hadwan MH, Hussein MJ, Mohammed RM, et al. An improved method for measuring catalase activity in biological samples. Biology Methods & Protocols 2024; 9: bpae015.
Lomonte B, Calvete JJ. Strategies in snake venomics aiming at an integrative view of compositional, functional, and immunological characteristics of venoms. J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis 2017; 23: 26.
Crowther JR. The ELISA guidebook (Methods in Molecular Biology; vol. 516), 2nd ed. New York: Humana Press; 2009; 65-74.
Tanaka M, Hayashi H, Ishii Y. Stabilization of colloidal Prussian blue in aqueous dispersions: effects of electrolytes and biopolymers. Colloids Surf B Biointerfaces 2003; 27: 133-42.
Ponder JW, Case DA. Force fields for protein simulations. Adv Protein Chem 2003; 66: 27-85.
Tasoulis T, Silva A, Veerati PC, Isbister GK. Intraspecific venom variation in the Australian Coastal Taipan Oxyuranus scutellatus. Toxins 2020; 12: 434.
ดาวน์โหลด
เผยแพร่แล้ว
รูปแบบการอ้างอิง
ฉบับ
ประเภทบทความ
สัญญาอนุญาต
ลิขสิทธิ์ (c) 2026 วารสารเทคนิคการแพทย์
อนุญาตภายใต้เงื่อนไข Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
