การพัฒนาเทคนิค Reverse Transcription-Quantitative Real-time PCR สำหรับตรวจหาการปนเปื้อนของไวรัสรีโทรไวรัสในเซลล์เพาะเลี้ยงที่ใช้ในการผลิตวัคซีน โดยใช้ Bacteriophage MS2 เป็นตัวแทนการศึกษา
คำสำคัญ:
รีโทรไวรัส, RT-qPCR, การตรวจสอบความถูกต้อง, เซลล์เพาะเลี้ยง, การผลิตวัคซีนบทคัดย่อ
ความปลอดภัยของวัคซีนเป็นปัจจัยสำคัญในการควบคุมโรคติดเชื้อ โดยเฉพาะวัคซีนที่ผลิตจากเซลล์เพาะเลี้ยงซึ่งอาจมีความเสี่ยงต่อการปนเปื้อนของไวรัส ที่สำคัญคือรีโทรไวรัส ซึ่งเป็นไวรัส RNA ที่สามารถแทรกตัวในจีโนมของเซลล์โฮสต์ผ่านเอนไซม์ reverse transcriptase การปนเปื้อนดังกล่าวอาจก่อให้เกิดความเสี่ยงต่อสุขภาพของผู้รับวัคซีน หน่วยงานกำกับดูแลจึงกำหนดให้มีการตรวจสอบรีโทรไวรัส การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของวิธี reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) ที่พัฒนาขึ้นสำหรับการตรวจหาเชื้อรีโทรไวรัสในเซลล์เพาะเลี้ยงที่ใช้ในกระบวนการผลิตวัคซีน โดยประเมินประสิทธิภาพผ่านการใช้ไวรัส MS2 bacteriophage เป็นต้นแบบของการศึกษา การตรวจสอบครอบคลุมถึงการประเมินความจำเพาะของไพรเมอร์ ความเป็นเส้นตรงของปฏิกิริยา ความเที่ยงของการทดสอบทั้งแบบภายในวันและระหว่างวัน รวมถึงระหว่างผู้ปฏิบัติงาน ขีดจำกัดของการตรวจพบ และความแม่นยำ จากการวิเคราะห์ความจำเพาะของไพรเมอร์ด้วยวิธี in silico Primer BLAST พบว่า ไพรเมอร์ที่ออกแบบมีความจำเพาะต่อ MS2 bacteriophage เท่านั้น และไม่เกิดปฏิกิริยาข้ามกับไวรัสชนิดอื่น ปฏิกิริยา RT-qPCR ที่พัฒนาขึ้นให้ผลลัพธ์ที่แม่นยำและสม่ำเสมอ สามารถตรวจพบเอนไซม์ในระดับความเข้มข้นต่ำได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยค่าความไวของการตรวจพบอยู่ในระดับ 500 ไมโครยูนิต/ไมโครลิตร และค่าการคืนกลับของการตรวจวัดอยู่ในเกณฑ์ที่กำหนด ดังนั้นผลการพัฒนาวิธี RT-qPCR แสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของการนำมาประยุกต์ใช้ร่วมกับงานประจำวันเพื่อใช้ตรวจหาเชื้อรีโทรไวรัสในเซลล์เพาะเลี้ยงที่ใช้ในการผลิตวัคซีน
เอกสารอ้างอิง
Birmingham CL, Dupont D, Riou P, Armanet C, Edamura KN, Martinho B, et al. Detection of Avian Retroviruses in Vaccines by Amplification on DF-1 Cells with Immunostaining and Fluorescent Product-Enhanced Reverse Transcriptase Endpoint Methods. J Clin Microbiol 2013; 51: 1496-504.
Al Fayez N, Nassar MS, Alshehri AA, Alnefaie MK, Almughem FA, Alshehri BY, et al. Recent Advancement in mRNA Vaccine Development and Applications. Pharmaceutics 2023; 15: 1972.
Artika IM, Dewi YP, Nainggolan IM, Siregar JE, Antonjaya U. Real-Time Polymerase Chain Reaction: Current Techniques, Applications, and Role in COVID-19 Diagnosis. Genes 2022; 13: 2387.
Dutta D, Naiyer S, Mansuri S, Soni N, Singh V, Bhat KH, et al. COVID-19 Diagnosis: A Comprehensive Review of the RT-qPCR Method for Detection of SARS-CoV-2. Diagnostics 2022; 12: 1503.
Watzinger F, Ebner K, Lion T. Detection and monitoring of virus infections by real-time PCR. Molecular Aspects Med 2006; 27: 254-98.
Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009; 55: 611-22.
U.S. Pharmacopeial Convention. General Chapter <1130> Nucleic acid-based techniques—approaches for detecting trace nucleic acids (residual DNA testing) [Internet]. 2012 [cited 2025 Jul 26]. Available from: http://usp35.infostar.com.cn/uspnf/pub/data/v35300/usp35nf30s0_c1130.html.
Broeders S, Huber I, Grohmann L, Berben G, Taverniers I, Mazzara M, et al. Guidelines for validation of qualitative real-time PCR methods. Trends Food Sci Technol 2014; 37: 115-26.
Ma H, Khan AS. Detection of Latent Retroviruses in Vaccine-related Cell Substrates: Investigation of RT Activity Produced by Chemical Induction of Vero Cells. PDA J Pharm Sci Technol 2011; 65: 685-9
Dittmer U, Brooks DM, Hasenkrug KJ. Characterization of a Live-Attenuated Retroviral Vaccine Demonstrates Protection via Immune Mechanisms. J Virol 1998; 72: 6554-8.
Victoria JG, Wang C, Jones MS, Jaing C, McLoughlin K, Gardner S, et al. Viral Nucleic Acids in Live-Attenuated Vaccines: Detection of Minority Variants and an Adventitious Virus. J Virol 2010; 84: 6033-40.
Pyra H, Böni J, Schüpbach J. Ultrasensitive retrovirus detection by a reversetranscriptase assay based on product enhancement. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 1544-8.
Pizzato M, Erlwein O, Bonsall D, Kaye S, Muir D, McClure MO. A one-step SYBR Green I-based product-enhanced reverse transcriptase assay for the quantitation of retroviruses in cell culture supernatants. J Virol Methods 2009; 156: 1-7.
Olveira JG, Souto S, Bandín I, Dopazo CP. Development and Validation of a SYBR Green Real Time PCR Protocol for Detection and Quantification of Nervous Necrosis Virus (NNV) Using Different Standards. Animals 2021; 11: 1100.
Zhang Y, Dong F, Xing J, Tang X, Sheng X, Chi H, et al. Characterization of Nervous Necrosis Virus (NNV) Nonstructural Protein B2 and Its Enhancement on Virus Proliferation. Viruses 2022; 14: 2818.
Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S, Madden TL. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics [Internet]. 2012 Dec; 13: 134 [cited 2025 Jul 26]. Available from: https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/
1186/1471-2105-13-134.
Tang Q, Zhou GC, Liu SJ, Li W, Wang YL, Xu GY, et al. Selection and Validation of Reference Genes for qRT-PCR Analysis of Gene Expression in Tropaeolum majus (Nasturtium). Horticulturae 2023; 9: 1176.
Kothapalli R, Danyluck GM, Bailey RD, Loughran TP. Problems associated with product enhancement reverse transcriptase assay using bacteriophage MS2 RNA as a template. J Virol Methods 2003; 109: 203-7.
Ma H, Bell KN, Loker RN. qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies. Mol Ther-Methods Clin. Dev 2021; 20: 152-68.
de Gonzalo-Calvo D, Marchese M, Hellemans J, Betsou F, Skov Frisk NL, Dalgaard LT, et al. Consensus guidelines for the validation of qRT-PCR assays in clinical research by the CardioRNA consortium. Mol Ther Methods Clin Dev 2022; 24: 171-80.
Schröder HM, Niebergall-Roth E, Norrick A, Esterlechner J, Ganss C, Frank MH, et al. Drug Regulatory-Compliant Validation of a qPCR Assay for Bioanalysis Studies of a Cell Therapy Product with a Special Focus on Matrix Interferences in a Wide Range of Organ Tissues. Cells 2023; 12: 1788.
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol 2019; 37: 761-74.
Forootan A, Sjöback R, Björkman J, Sjögreen B, Linz L, Kubista M. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomol Detect Quantif 2017; 12: 1-6.
Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill [Internet]. 2020 Jan 23 [cited 2025 Jul 28]; 25(3). Available from: https://www.eurosurveillance.org/content/10.2807/1560-7917.ES.2020.
3.2000045.
Souto S, Olveira JG, López-Vázquez C, Bandín I, Dopazo CP. Designing and Validation of a Droplet Digital PCR Procedure for Diagnosis and Accurate Quantification of Nervous Necrosis Virus in the Mediterranean Area. Pathogens 2023; 12: 1155.
Suo T, Liu X, Feng J, Guo M, Hu W, Guo D, et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerg microbes & infect 2020; 9: 1259-68.
Ding J, Xu X, Deng Y, Zheng X, Zhang T. Comparison of RT-ddPCR and RT-qPCR platforms for SARS-CoV-2 detection: Implications for future outbreaks of infectious diseases. Environ Int 2024; 183: 108438.
US Food and Drug Administration. Guidance for industry: Characterization and qualification of cell substrates and other biological materials used in the production of viral vaccines for infectious disease indications [Internet]. Silver Spring (MD): FDA; 2010 [cited 2025 Apr 11]. Available from: https://www.fda.gov/media/78428/download.
Center for Biologics Evaluation and Research. Q5A viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin [Internet]. Silver Spring (MD): US FDA; 2024
Jan [cited 2025 Jul 28]. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-
fda-guidance-documents/q5ar2-viral-safety-evaluation-biotechnology-products-derived-cell-lines-
human-or-animal-origin.
Rodríguez RA, Pepper IL, Gerba CP. Application of PCR-Based Methods To Assess the Infectivity of Enteric Viruses in Environmental Samples. Appl Environ Microbiol 2009; 75: 297-307.
Ahmed W, Smith WJM, Metcalfe S, Jackson G, Choi PM, Morrison M, et al. Comparison of RT-qPCR and RT-dPCR Platforms for the Trace Detection of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater. ACS ES T Water 2022; 2: 1871-80.
Shinde M, Lavania M, Rawal J, Chavan N, Shinde P. Evaluation of droplet digital qRT-PCR (dd qRT-PCR) for quantification of SARS CoV-2 RNA in stool and urine specimens of COVID-19 patients. Front Med (Lausanne) [Internet]. 2023 Jun 26 [cited 2025 Jul 26]; 10: 1148688. Available from: https://
www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2023.1148688/full.
Chinese Center for Food and Drug Inspection. Common problems and technical requirements of replication-competent lentivirus detection [Internet]. 2024 Dec [cited 2025 Apr 11]. Available from: https://www.ccfdie.org/en/fgflf/webinfo/2024/12/1732613154516555.htm.
Guidance for Industry, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Supplemental guidance on testing for replication-competent retrovirus in retroviral vector-based gene therapy products and during follow-up of patients in clinical trials using retroviral vectors [Internet]. Hum Gene Ther. 2001 Feb 10 [cited 2025 Jun 11]. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11177567/.
European Medicines Agency. Virus safety evaluation of biotechnological investigational medicinal products – Scientific guideline [Internet]. London: EMA; 2009 Feb 01 [cited 2025 Apr 11]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/virus-safety-evaluation-biotechnological-investigational-medicinal-products-scientific-guideline.
ดาวน์โหลด
เผยแพร่แล้ว
รูปแบบการอ้างอิง
ฉบับ
ประเภทบทความ
สัญญาอนุญาต
ลิขสิทธิ์ (c) 2026 วารสารเทคนิคการแพทย์
อนุญาตภายใต้เงื่อนไข Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
