ความเข้มข้นของไฟโตฮีแมกกลูตินินในปฏิกิริยามีผลต่อการวัดและวิเคราะห์ปริมาณเซลล์ลิมโฟไซต์ด้วยเทคนิค MTT assay

บทคัดย่อ

MTT assay เป็นเทคนิคที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับตรวจวิเคราะห์สมบัติภูมิคุ้มกันของเซลล์ อย่างไรก็ตามเทคนิคดังกล่าวยังมีข้อจำกัดจากการจับตัวเป็นก้อนของเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดนิวเคลียสเดี่ยว (PBMC) หลังใส่สารกระตุ้นไฟโตฮีแมกกลูตินิน (PHA) โดยพบว่ามีผลทำให้การอ่านค่าการดูดกลืนแสงผิดพลาด ส่งผลให้ผลวิเคราะห์การทดลองคลาดเคลื่อน การวิจัยนี้ได้ศึกษา (1) ผลกระทบของขนาดกลุ่มก้อนเซลล์ PBMC หลังการกระตุ้นด้วย PHA ต่อผลการวัดค่าการดูดกลืนแสง ในเทคนิค MTT และ (2) ศึกษาหาความเข้มข้นและระยะเวลาของ PHA ที่เหมาะสมในปฏิกิริยากระตุ้นเซลล์ PBMC ร่วมกับการใช้สารคีเลตเพื่อลดการจับตัวเป็นก้อนของเซลล์ PBMC โดยได้จัดเก็บเลือดและเตรียมเซลล์ PBMC เพื่อทำปฏิกิริยากับ PHA ที่ความเข้มข้นต่างกัน 2 ระดับ คือ 1 และ 5 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร (µg/mL) และนำไปวัดหาค่าการดูดกลืนแสง ส่วนการทดลองที่สองได้ทดสอบบ่มเพาะเซลล์ PBMC ร่วมกับ PHA ที่ความเข้มข้น 1 และ 5 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ในช่วงเวลาต่างกัน โดยมีการใช้สารคีเลตร่วมในบางช่วงเวลา และนำไปเปรียบเทียบค่าการดูดกลืนแสง  ผลการศึกษาพบว่า PHA 5 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร เป็นความเข้มข้นที่ทำให้เกิดกลุ่มก้อน PBMC ขนาดใหญ่มีปริมาณมากกว่า และให้ค่าการดูดกลืนแสงที่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p value < 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับการใช้ PHA 1 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร อีกทั้งพบว่าการใช้ PHA 1 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ที่เวลานาน 5 ชั่วโมง ร่วมกับการเติมสารคีเลต (EDTA) ส่งผลให้ได้ค่าการดูดกลืนแสงที่สูงและลดการจับตัวเป็นก้อนของเซลล์ PBMC  สรุปได้ว่าการเติม EDTA ร่วมกับ PHA ความเข้มข้น 1 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ในการกระตุ้นเซลล์ PBMC สามารถลดการจับตัวเป็นก้อนของเซลล์ PBMC และให้ค่าการดูดกลืนแสงที่เหมาะสมต่อการทดสอบด้วยเทคนิค MTT assay