การพัฒนาวิธีตรวจการกลายพันธุ์ชนิด A1762T/G1764A บริเวณ basal core promoter ของไวรัสตับอักเสบบีด้วยเทคนิค SYBR Green I qPCR ร่วมกับ melting curve analysis

บทคัดย่อ

การกลายพันธุ์ของเชื้อไวรัสตับอักเสบบีบริเวณยีน basal core promoter (BCP) A1762T/G1764A  มีความสัมพันธ์กับการดำเนินโรคของผู้ป่วยไวรัสตับอักเสบบีที่ติดเชื้อแบบเรื้อรัง ซึ่งต้องตรวจด้วยเทคนิคทางอณูชีววิทยา ในประเทศไทยปัจจุบันชุดตรวจสำเร็จรูปที่มีใช้มีราคาสูงทำให้ผู้ป่วยขาดโอกาสที่จะเข้าถึงการตรวจ การศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาวิธีตรวจวินิจฉัยการกลายพันธุ์บริเวณ BCP ตำแหน่ง A1762T/G1764A ของไวรัสตับอักเสบบีด้วยวิธี SYBR Green I qPCR ร่วมกับ melting curve analysis เปรียบเทียบประสิทธิภาพกับวิธี  nested PCR-RFLP ซึ่งเป็นเทคนิคที่ใช้ในปัจจุบัน ศึกษาโดยการใช้ตัวอย่างดีเอ็นเอของผู้ป่วยติดเชื้อไวรัสตับอักเสบบีแบบเรื้อรังจำนวน 30 ตัวอย่าง  ผลการศึกษา melting curve analysis ของวิธีนี้ได้ค่าเฉลี่ย + ความแปรปรวน melting temperature ของการกลายพันธุ์ A1762T/G1764A และ wild type เท่ากับ 77.19 ± 0.32 องศาเซลเซียส และ 80.70 ± 0.37 องศาเซลเซียสตามลำดับ เมื่อใช้พลาสมิดควบคุมจะได้ประสิทธิภาพ และค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ที่ได้รับการยอมรับ และสามารถตรวจหาปริมาณดีเอ็นเอของไวรัสได้ที่ความข้มข้นไม่ต่ำกว่า 6,460 copiesต่อมิลลิลิตรอีกด้วย  นอกจากนั้นเมื่อเปรียบเทียบกับวิธี nested PCR-RFLP พบว่าให้ผลที่ถูกต้องมากกว่า เมื่อตรวจสอบผลที่ขัดแย้งของสองวิธีด้วย direct sequencing ผลการวิจัยสรุปได้ว่าวิธี SYBR Green I qPCR ร่วมกับ melting curve analysis มีความไวและความความถูกต้องสูงในการตรวจหาการกลายพันธุ์ไวรัสบีที่ตำแหน่ง A1762T/G1764A รวมทั้งสามารถหาปริมาณดีเอ็นเอของไวรัสบีได้ด้วย  อีกทั้งต้นทุนในการตรวจวิเคราะห์มีราคาถูก เหมาะสมที่จะนำมาพัฒนาเพื่อตรวจประเมินรักษาผู้ป่วยไวรัสตับอักเสบบีเรื้อรังในประเทศไทยในอนาคต