การตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการวิเคราะห์ปริมาณไวรัสพาร์โวจากหมูในเซลล์เพาะเลี้ยงที่ใช้ในการผลิตวัคซีนด้วยวิธีเรียลไทม์พีซีอาร์
Article Sidebar
Main Article Content
บทคัดย่อ
ความสำคัญ: เซลล์เพาะเลี้ยงมีบทบาทสำคัญในการผลิตวัคซีนหลากหลายชนิด แต่หากเกิดการปนเปื้อนไวรัสจากวัตถุดิบในการผลิตวัคซีนหรือสารชีววัตถุ อาจก่อโรคและเป็นปัจจัยเสี่ยงที่มีความสำคัญต่อผู้รับวัคซีนหรือสารชีววัตถุนั้น การตรวจหาเชื้อไวรัสปนเปื้อนในเซลล์เพาะเลี้ยงเป็นหนึ่งในข้อกำหนดที่องค์การอนามัยโลกระบุไว้ เพื่อป้องกันการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์และการข้ามสายพันธุ์ระหว่างชนิด ซึ่งทดสอบวิธีการตรวจหาการปนเปื้อนของเชื้อไวรัส PPV ในเซลล์เพาะเลี้ยงที่ใช้ในการผลิตวัคซีนมีหลายวิธี แต่วิธี Real-time PCR ยังไม่มีการทดสอบในสถาบันชีววัตถุ กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ของไทย
วัตถุประสงค์: เพื่อพัฒนาและทดสอบวิธีการตรวจหาการปนเปื้อนของเชื้อไวรัส PPV ในเซลล์เพาะเลี้ยงที่ใช้ในการผลิตวัคซีนด้วยวิธี Real-time PCR และเพื่อใช้เป็นวิธีมาตรฐานในการควบคุมคุณภาพเซลล์เพาะเลี้ยงที่ใช้ในการผลิตวัคซีน
วิธีการวิจัย: เป็นการวิจัยเชิงทดลองระหว่างเดือนพฤศจิกายน 2564 ถึงตุลาคม 2565 โดยศึกษาสภาวะที่เหมาะสมของเทคนิคในการตรวจวิเคราะห์หาปริมาณไวรัสจากหมูในเซลล์์เพาะเลี้ยงที่ใช้้ในการผลิตวัคซีนด้วยวิธีเรียลไทม์พีซีอาร์ และตรวจสอบความถูกต้องของวิธีในพารามิเตอร์ การตรวจสอบความเป็นเส้นตรงและช่วงการวิเคราะห์ ความจำเพาะ ความเที่ยง ความแม่น ปริมาณขั้นต่ำสุดของการตรวจพบได้ และความไว
ผลการศึกษา: ผลการทดลองพบว่า primers และ probes ที่ออกแบบขึ้นสามารถเพิ่มปริมาณยีนเป้าหมายของไวรัส PPV ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยไม่เกิดปฏิกิริยาข้ามกับไวรัสชนิดอื่น กราฟมาตรฐานของ PPV DNA มีช่วงความเป็นเส้นตรงอยู่ระหว่าง 8–4 log10 copies/µl โดยมีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ (r²) เท่ากับ 0.9996 การวิเคราะห์ความสามารถในการทำซ้ำ ทั้งการวิเคราะห์ในวันเดียวกัน การวิเคราะห์ต่างวัน และการวิเคราะห์โดยนักวิเคราะห์ที่แตกต่างกัน พบว่าค่าสัมประสิทธิ์ความแปรปรวน (CV) อยู่ในเกณฑ์ที่ยอมรับได้ (CV< 25%) การทดสอบความแม่นยำของวิธีมีค่า %CV เท่ากับ 0.510 และมีร้อยละการกลับคืนอยู่ในช่วง 101.391-100.663 เมื่อศึกษาประสิทธิภาพในการตรวจพบการปนเปื้อน พบว่าขีดจำกัดของการตรวจพบที่ให้ผลบวกสูงถึง 95% อยู่ที่ 1,857 copies/µl และความไวในการตรวจหาปริมาณไวรัส PPV ในเซลล์เพาะเลี้ยง ST อยู่ที่ 7.5 TCID50/ml หรือ 4 log10 copies/µl
สรุป: วิธีการที่พัฒนาขึ้นนี้มีความเหมาะสมและสามารถนำไปใช้ในการวิเคราะห์ปริมาณไวรัสจากหมูในเซลล์เพาะเลี้ยงที่ใช้ในการผลิตวัคซีนได้อย่างมีประสิทธิภาพ
Article Details
อนุญาตภายใต้เงื่อนไข Creative Commons Attribution 4.0 International License.
เอกสารอ้างอิง
1. Fikrig MK, Tattersall P. Latent parvoviral infection of continuous cell lines. Dev Biol Stand. 1992; 76:285–93. PMID: 1335934.
2. Croghan DL, Matchett A, Koski TA. Isolation of porcine parvovirus from commercial trypsin. Appl Microbiol. 1973 Sep;26(3):431–3. PMID: 4584585.
3. Streck AF, Canal CW, Truyen U. Molecular epidemiology and evolution of porcine parvoviruses. Infection, Genetics and Evol. 2015 Dec;36:300–6. doi:10.1016/j.meegid.2015.08.002.
4. Soares RM, Cortez A, Heinemann MB, Sakamoto SM, Martins VG, Bacci M, et al. Genetic variability of porcine parvovirus isolates revealed by analysis of partial sequences of the structural coding gene VP2. J Gen Virol. 2003 Jun;84(6):1505–15. doi: 10.1099/vir.0.19011-0.
5. Center for Biologics Evaluation and Research. Guidance for Industry-characterization and qualification of cell substrates and other biological materials used in the production of viral vaccines for infectious disease indications [Internet]. Geneva: U.S FDA; 2022 Apr [cited 2022 Apr 22];50. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/characterization-and-qualification-cell-substrates-and-other-biological-materials-used-production
6. European Medicines Agency. Guideline on the use of porcine trypsin used in the manufacture of human biological medicinal products: 8 [Internet]. 2014 Mar [cited 2022 Apr 1]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/use-porcine-trypsin-used-manufacture-human-biological-medicinal-products-scientific-guideline
7. ดวงดาว วิชาดากุล. ชีวสารสนเทศ 1 แนวทางอัลกอริทึม [อินเทอร์เน็ต]. ภาควิชาวิศวกรรมคอมพิวเตอร์ คณะวิศวกรรมศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย; 2561 [เข้าถึงเมื่อ 24 ก.ค. 2566]. เข้าถึงได้จาก: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60368
8. Whelan JA, Russell NB, Whelan MA. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. J Immunological Methods. 2003 Jul;278(1–2):261–9. doi: 10.1016/S0022-1759(03)00223-0.
9. Broeders S, Huber I, Grohmann L, Berben G, Taverniers I, Mazzara M, et al. Guidelines for validation of qualitative real-time PCR methods. Trends Food Sci Technol. 2014 Jun;37(2):115–26. doi:10.1016/j.tifs.2014.03.008.
10. International Organization for Standardization. ISO 20395:2019. Biotechnology — Requirements for evaluating the performance of quantification methods for nucleic acid target sequences — qPCR and dPCR. Geneva: ISO; 2019. Available from: https://www.iso.org/standard/68554.html.
11. Soares RM, Durigon EL, Bersano JG, Richtzenhain LJ. Detection of porcine parvovirus DNA by the polymerase chain reaction assay using primers to the highly conserved nonstructural protein gene, NS-1. J Virol Methods. 1999 Mar;78(1–2):191–8. doi:10.1016/S0166-0934(99)00010-4. PMID: 10204709.
12.Chen HY, Li XK, Cui BA, Wei ZY, Li XS, Wang YB, et al. A TaqMan-based real-time polymerase chain reaction for the detection of porcine parvovirus. J Virol Methods. 2009 Mar;156(1–2):84–8. doi: 10.1016/j.jviromet.2008.12.014.
13. Forootan A, Sjöback R, Björkman J, Sjögreen B, Linz L, Kubista M. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomol Detect Quantif. 2017 Jun;12:1–6. doi: 10.1016/j.bdq.2017.04.001.
14. Haugland RA, Siefring S, Varma M, Oshima KH, Sivaganesan M, Cao Y, et al. Multi-laboratory survey of qPCR enterococci analysis method performance in U.S. coastal and inland surface waters. J Microbiol Methods. 2016 Apr;123:114–25. doi:10.1016/j.mimet.2016.02.015.
15. Klymus KE, Merkes CM, Allison MJ, Goldberg CS, Helbing CC, Hunter ME, et al. Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays. Environ DNA. 2020 Jul;2(3):271–82. doi:10.1002/edn3.29.
16. European Commission. Joint Research Centre. Institute for Health and Consumer Protection. Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing: European Network of GMO Laboratories (ENGL) [Internet]. LU: EU; 2008 [cited 2023 Feb 19]. Available from: https://data.europa.eu/doi/10.2788/65827
17. Wilhelm J. Real-time PCR-based method for the estimation of genome sizes. Nucleic Acids Research. Nucleic Acids Res. 2003 May;31(10):e56. doi: 10.1093/nar/gng056.
18. Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, Rasmussen RP. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. BioTechniques. 1997 Jan;22(1):130–8. doi: 10.2144/97221bi01.
19. Ni J, Qiao C, Han X, Han T, Kang W, Zi Z, et al. Identification and genomic characterization of a novel porcine parvovirus (PPV6) in China. Virol J. 2014 Dec;11(1):203. doi: 10.1186/s12985-014-0203-2.
20. Mészáros I, Olasz F, Cságola A, Tijssen P, Zádori Z. Biology of Porcine Parvovirus (Ungulate parvovirus 1). Viruses. 2017 Dec;9(12):393. doi:10.3390/v9120393.
