การพัฒนาและตรวจสอบความถูกต้องของวิธีวิเคราะห์เอกลักษณ์ของยาริทูซิแมบโดยใช้เทคนิค Intact Mass Spectrometry
Article Sidebar
Main Article Content
บทคัดย่อ
ความสำคัญ: ยาริทูซิแมบ (Rituximab) เป็นโมโนโคลนอลแอนติบอดี (Monoclonal Antibodies: mAbs) ที่มีความสำคัญทางการแพทย์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการรักษาโรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ มะเร็งต่อมน้ำเหลืองชนิดนอน-ฮอดจ์กิน และมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดลิมโฟไซต์เรื้อรัง การที่ริทูซิแมบผลิตด้วยเทคโนโลยี recombinant DNA ส่งผลให้เกิดความหลากหลายในเชิงโครงสร้างและการดัดแปลงหลังการแปลรหัส (Post-translational modifications: PTMs) เช่น รูปแบบไกลโคซิเลชัน (glycosylation variants) ซึ่งอาจมีผลกระทบโดยตรงต่อความปลอดภัย ประสิทธิภาพ และคุณภาพของผลิตภัณฑ์ ดังนั้น การควบคุมคุณภาพของริทูซิแมบทั้งชนิดยาต้นแบบ (originator) และยาชีววัตถุคล้ายคลึง (biosimilars) ที่วางจำหน่ายในท้องตลาด จึงมีความจำเป็นอย่างยิ่งที่ต้องใช้เทคนิคการวิเคราะห์ที่มีความแม่นยำสูง ด้วยเทคนิค UHPLC-Q/TOF โดยอาศัยหลักการวิเคราะห์อัตราส่วนมวลต่อประจุ (m/z) ของโมเลกุลโดยตรง เพื่อยืนยันโครงสร้างระดับปฐมภูมิจากน้ำหนักโมเลกุลรวมและตรวจสอบข้อมูลการดัดแปลงหลังการแปลรหัส วิธีการนี้ถือเป็นหนึ่งในแนวทางมาตรฐานในการประเมินคุณภาพ
วัตถุประสงค์: พัฒนาและทดสอบความถูกต้องของวิธีวิเคราะห์มวลที่สมบูรณ์ (intact mass) ของริทูซิแมบด้วยเทคนิค UHPLC-Q/TOF ตามแนวทางสากลของ ICH guideline Q2(R2) เพื่อให้ได้วิธีมาตรฐานในการวิเคราะห์เอกลักษณ์และการควบคุมคุณภาพในห้องปฏิบัติการ
วิธีการวิจัย: การวิจัยเชิงทดลองนี้เป็นวิธีวิเคราะห์ได้รับการพัฒนาจากการทบทวนวรรณกรรมและการหาสภาวะที่เหมาะสม (method development) โดยการเตรียมตัวอย่างยาต้นแบบและยาชีววัตถุคล้ายคลึงที่มีความบริสุทธิ์สูงผ่านกระบวนการกำจัดเกลือ และการกำหนดความเข้มข้นโปรตีนที่ 1.0 mg/ml เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการไอออไนซ์ สภาวะการวิเคราะห์ที่เหมาะสมประกอบด้วยการใช้คอลัมน์ชนิด reversed-phase และ gradient elution โดยใช้ 0.1% v/v formic acid ในน้ำ (เฟสเคลื่อนที่ A) และ 0.1% v/v formic acid ใน Acetonitrile (เฟสเคลื่อนที่ B) การตรวจสอบความถูกต้องของวิธี (method validation) ดำเนินการตามพารามิเตอร์หลัก ได้แก่ ความจำเพาะ ความเที่ยง และความคงทน เพื่อยืนยันความน่าเชื่อถือของวิธี และตัวอย่าง monoclonal antibody ชนิดอื่น 2 ชนิด ได้แก่ trastuzumab และ bevacizumab สำหรับการทดสอบประสิทธิภาพในการตรวจสอบโครงสร้างระดับปฐมภูมิจากน้ำหนักโมเลกุลรวมและข้อมูลการดัดแปลงหลังการแปลรหัส (PTMs) ดำเนินการศึกษาระหว่างวันที่ 1 ตุลาคม 2565 - 30 กันยายน 2566
ผลการศึกษา: จากการทดสอบความพร้อมของระบบ (System Suitability Test) ด้วยสารมาตรฐาน NIST monoclonal antibody พบว่าค่าความคลาดเคลื่อนของมวล (mass accuracy) ของ major glycoforms อยู่ในเกณฑ์ที่ยอมรับได้ (±20 ppm) ซึ่งยืนยันความน่าเชื่อถือของเครื่องมือที่มีความแม่นยำสูง ผลการตรวจสอบความถูกต้องของวิธีแสดงให้เห็นดังนี้ (1) ความจำเพาะ พบว่าการวิเคราะห์ Blank ไม่พบสัญญาณของ major glycoforms ที่สอดคล้องกับริทูซิแมบ พบ major glycoforms ของยาชีววัตถุคล้ายคลึงมีความสอดคล้องกับยาต้นแบบ โดยมวลโมเลกุลรวมของ major glycoform คือ 147,243 kDa และมีความแตกต่างจากมวลเป้าหมาย (target mass) เพียง 3 Da ซึ่งน้อยกว่าเกณฑ์ที่กำหนด (±10 Da) รวมทั้งการวิเคราะห์โมโนโคลนอลแอนติบอดีชนิดอื่น ได้แก่ ทราสทูซูแมบ (trastuzumab) และบีวาซิซูแมบ (bevacizumab) ไม่พบ major glycoforms ที่สอดคล้องกับริทูซิแมบ ยืนยันว่าวิธีนี้มีความจำเพาะสูงต่อริทูซิแมบ (2) ความเที่ยง พบว่าการทดสอบความสามารถในการทำซ้ำภายในวันเดียวกัน และความแม่นยำระหว่างนักวิเคราะห์/ต่างวัน แสดงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ (%RSD) ต่ำมาก โดยค่า %RSD สำหรับการทำซ้ำภายในวันเดียวกันเท่ากับ 0.0004 และการทดสอบความเที่ยงระหว่างวัน/ระหว่างนักวิเคราะห์มีค่า %RSD เท่ากับ 0 ซึ่งทั้งหมดต่ำกว่าเกณฑ์การยอมรับที่กำหนด และ (3) ความคงทน ได้ทดสอบโดยการเปลี่ยนแปลงอายุของตัวอย่าง (เก็บที่ -30 °C เป็นเวลา 7 วัน) พบว่าค่ามวลของ major glycoforms ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p> 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับตัวอย่างที่วิเคราะห์ทันที ยืนยันความคงทนของวิธีวิเคราะห์ต่อการเปลี่ยนแปลงสภาวะการเก็บรักษาตัวอย่าง
สรุป: วิธีวิเคราะห์ intact mass ของริทูซิแมบด้วยเทคนิค UHPLC-Q/TOF MS ที่พัฒนาขึ้นนี้แสดงให้เห็นถึงความจำเพาะ ความเที่ยง และความคงทนในระดับสูง ซึ่งเหมาะสำหรับการนำไปใช้เป็นวิธีมาตรฐานในห้องปฏิบัติการเพื่อยืนยันเอกลักษณ์และการควบคุมคุณภาพและประสิทธิภาพของริทูซิแมบก่อนจำหน่าย วิธีนี้ยังเป็นเครื่องมือสำคัญในการประเมินความคล้ายคลึงของโครงสร้างระดับปฐมภูมิระหว่างยาชีววัตถุคล้ายคลึงและยาต้นแบบ อย่างไรก็ตาม เพื่อเพิ่มความสมบูรณ์ของการวิเคราะห์ในอนาคตควรพิจารณาการใช้เอนไซม์ deglycosylase เพื่อกำจัดหมู่น้ำตาล ซึ่งจะช่วยลดความซับซ้อนและให้ข้อมูลมวลโมเลกุลรวมที่ปราศจากน้ำตาล และเพิ่มการศึกษาเปรียบเทียบกับคอลัมน์วิเคราะห์จากผู้ผลิตรายอื่น เพื่อเพิ่มทางเลือกในการใช้งานและลดความเสี่ยงจากการขาดแคลนอุปกรณ์
Article Details
อนุญาตภายใต้เงื่อนไข Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
เอกสารอ้างอิง
1.Kwon O, Joung J, Park Y, Kim CW, Hong SH. Considerations of critical quality attributes in the analytical comparability assessment of biosimilar products. Biologicals. 2017;48:101-8. doi: 10.1016/j.biologicals.2017.04.005
2.Lee KH, Lee J, Bae JS, Kim YJ, Kang HA, Kim SH, et al. Analytical similarity assessment of rituximab biosimilar CT-P10 to reference medicinal product. MAbs. 2018;10(3):380-96. doi: 10.1080/19420862.2018.1433976.
3.Cerutti ML, Pesce A, Bès C, Seigelchifer M. Physicochemical and biological characterization of RTXM83, a new rituximab biosimilar. BioDrugs. 2019;33:307-19. doi: 10.1007/s40259-019-00349-2.
4.Gürcan HM, Keskin DB, Stern JN, Nitzberg MA, Shekhani H, Ahmed AR. A review of the current use of rituximab in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 2009;9(1):10-25. doi: 10.1016/j.intimp.2008.10.004.
5.Maloney DG. Anti-CD20 antibody therapy for B-cell lymphomas. N Engl J Med. 2012;366(21):2008-16. doi: 10.1056/NEJMct1114348.
6.Montacir O, Montacir H, Eravci M, Springer A, Hinderlich S, Saadati A, et al. Comparability study of Rituximab originator and follow-on biopharmaceutical. J Pharm Biomed Anal. 2017;140:239-51. doi: 10.1016/j.jpba.2017.03.029.
7.Xu Y, Xie L, Zhang E, Gao W, Wang L, Cao Y, et al. Physicochemical and functional assessments demonstrating analytical similarity between rituximab biosimilar HLX01 and the MabThera®. MAbs. 2019;11(3):606-20. doi: 10.1080/19420862.2019.1578147.
8.Cornes P. The economic pressures for biosimilar drug use in cancer medicine. Target Oncol. 2012;7:57-67. doi: 10.1007/s11523-011-0196-3
9.สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ. การพัฒนาศักยภาพในการผลิตสารชีวภัณฑ์มูลค่าสูงในประเทศไทยและประเทศภูมิภาคอาเซียน [อินเทอร์เน็ต]. 2568 [เข้าถึงเมื่อ 26 ก.ย. 2568]. เข้าถึงได้จาก: https://www.nstda.or.th/nac/2021/2021/03/18/vaccine02-biopharmaceuticals/index.html.
10.Storz U. Rituximab: how approval history is reflected by a corresponding patent filing strategy. MAbs. 2014;6(4):820-37. doi: 10.4161/mabs.29105.
11.Beck A, Wagner-Rousset E, Ayoub D, Van Dorsselaer A, Sanglier-Cianférani S. Characterization of therapeutic antibodies and related products. Anal Chem. 2013;85(2):715-36. doi: 10.1021/ac3032355.
12.Wang H, Wu L, Wang C, Xu J, Yin H, Guo H, et al. Biosimilar or not: physicochemical and biological characterization of MabThera and its two biosimilar candidates. ACS Pharmacol Transl Sci. 2021;4(2):790-801. doi: 10.1021/acsptsci.0c00225
13.The United States Pharmacopeia. National formulary. <736> Mass spectrometry. Rockville (MD): United States Pharmacopeial Convention. [Internet]. 2018 [cited 2025 September 26]. Available from: https://online.uspnf.com/uspnf/document/1_GUID-1121F1D0-AFE7-4506-94CF-9112714BE4EB_2_en-US?source=Search%20Results&highlight=mass%20736
14.Hebbi V, Chattopadhyay S, Rathore AS. High performance liquid chromatography (HPLC) based direct and simultaneous estimation of excipients in biopharmaceutical products. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2019;1117:118-26. doi: 10.1016/j.jchromb.2019.04.022
15.Visser J, Feuerstein I, Stangler T, Schmiederer T, Fritsch C, Schiestl M. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 2013;27:495-507. doi: 10.1007/s40259-013-0036-3
16.Perdomo-Abúndez FC, Vallejo-Castillo L, Vázquez-Leyva S, López-Morales CA, Velasco-Velázquez M, Pavón L, et al. Development and validation of a mass spectrometric method to determine the identity of rituximab based on its microheterogeneity profile. J Chromatogr B. 2020;1139:121885. doi: 10.1016/j.jchromb.2019.121885
17.Formolo T, Ly M, Levy M, Kilpatrick L, Lute S, Phinney K, Marzilli L, Brorson K, Boyne M, Davis D and Schiel J. Determination of the NISTmAb primary structure. In: State-of-the-art and emerging technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization volume 2. Biopharmaceutical characterization: the NISTmAb case study. American Chemical Society; 2015. p. 1–62. doi:10.1021/bk-2015-1201.ch001
18.Precise Characterization of Intact Monoclonal Antibodies by the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF. Agilent application note. [Internet]. 2017 [cited 2025 Sep 26]. Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5991-7813EN.pdf
19.Donnelly DP, Rawlins CM, DeHart CJ, Fornelli L, Schachner LF, Lin Z, Lippens JL, Aluri KC, Sarin R, Chen B and Lantz C. Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry. Nat Methods. 2019;16(7):587–94. doi: 10.1038/s41592-019-0457-0
20.International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH). ICH Q2(R2): Validation of analytical procedures [Internet]. 2025 [cited 2025 Sept 15]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-q2r2-guideline-validation-analytical-procedures-step-5-revision-1_en.pdf
21.Gomes RA, Almeida C, Correia C, Guerreiro A, Simplício AL, Abreu IA, Alves PG. Exploring the analytical power of the QTOF MS platform to assess monoclonal antibodies quality attributes. PLoS One. 2019;14(7):e0219156. doi:10.1371/journal.pone.0219156
