การศึกษาเพื่อประเมินน้ำยาตรวจหาอัลลีล HLA ด้วยเทคนิค Next Generation Sequencing

บทคัดย่อ

บทคัดย่อ

ความเป็นมา ปัจจุบันมีผู้ป่วยคนไทยจำนวนมากที่ขึ้นทะเบียนรอรับเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดโลหิตจาก Thai Stem Cell Donor Registry แต่ยังไม่สามารถหาผู้บริจาคที่ไม่ใช่ญาติที่มี human leukocyte antigens (HLA) ตรงกันปัจจัยหนึ่งที่ส่งผลต่อการคัดเลือกคือ การตรวจชนิดของอัลลีล HLA ในผู้บริจาคที่รายงานผลเป็น low/intermediate resolution ทำให้ต้องใช้เวลาตรวจ high resolution เพิ่มเติมเพื่อระบุชนิดของอัลลีล HLA ทั้ง HLA-A, -B, -C และ -DRB1 วัตถุประสงค์ เพื่อประเมินชุดน้ำยาตรวจหาอัลลีล HLA แบบ high resolution ด้วยเทคนิค next generation sequencing (NGS) วัสดุและวิธีการ ประเมินการตรวจอัลลีล HLA ในตัวอย่างดีเอ็นเอที่ทราบผลแล้ว 24 ตัวอย่างโดยใช้ชุดน้ำยาของบริษัทต่างประเทศ และเปรียบเทียบผลการตรวจอัลลีลHLA ทั้ง 5 loci (HLA-A, -B, -C, -DRB1 และ -DQB1) กับผลที่ได้จากโครงการทดสอบความชำนาญสำหรับการตรวจ HLA ผลการศึกษา ผลตรวจอัลลีล HLA ถูกต้องเป็น single allele ของแต่ละ locus แบบ 4 ตำแหน่งด้วยชุดน้ำยา 3 บริษัท คือ Holotype HLA 99.58%; NGSgo 99.16%  และ AllType NGS assay 99.58% ส่วนระยะเวลาที่ใช้ในการตรวจทั้งหมดนั้นแตกต่างกัน ตั้งแต่ 31 ชั่วโมง (AllType NGS assay) 32 ชั่วโมง (NGSgo) และ 41 ชั่วโมง 30 นาที (Holotype HLA) ตามลำดับ ข้อจำกัดในการแปลผลเกิดจากการออกแบบไพรเมอร์ของอัลลีล HLA ที่แตกต่างกัน โปรแกรมการวิเคราะห์และประสบการณ์ของบุคลากร ทำให้เวลาของการประมวลผลแตกต่างกัน สรุป การศึกษานี้ได้ประเมินชุดน้ำยาของบริษัทต่างประเทศเพื่อตรวจอัลลีล HLA ระดับ high resolution ด้วยเทคนิค NGS โดยตรวจในตัวอย่างควบคุมคุณภาพซึ่งผลการตรวจถูกต้องมากกว่าร้อยละ 99 แต่มีความแตกต่างกันในเรื่องของระยะเวลา ขั้นตอนการตรวจและการวิเคราะห์ผลด้วยโปรแกรมสำเร็จรูป  อย่างไรก็ตามการเลือกใช้ชุดน้ำยาอาจต้องพิจารณาความเหมาะสมเรื่องต้นทุนน้ำยาและจำนวนตัวอย่างที่ทดสอบด้วย

Abstract:

Background: Currently, many Thai patients who have registered for unrelated stem cell donors from the Thai Stem Cell Donor Registry (TSCDR) but could not find human leukocyte antigens (HLA) - matched donors. One factor that influenced the selection was donors’ HLA allele typing results reported as low/intermediate resolution. Thus, more time was needed to perform high resolution typing in order to identify HLA-A, -B, -C and -DRB1 alleles. Objective: To evaluate next generation sequencing (NGS) platforms for high resolution HLA allele typing. Materials and Methods: HLA allele typing was performed in 24 known DNA samples using commercial reagent kits. The HLA typing results of 5 loci (HLA-A, -B, -C, -DRB1 and -DQB1) were compared with the results obtained from the proficiency testing programs. Results: The three commercial kits could identify 4 digits resolution typing of each locus and the concordance with the known alleles was 99.58%, 99.16% and 99.58% for Holotype HLA, NGSgo, and AllTypeNGS assay, respectively. Times requiring for the whole process of typing varied from 31 hours (AllTypeNGS assay), 32 hours (NGSgo) and 41 hours and 30 minutes (Holotype HLA), respectively. Test limitations were due to different primer design and software analysis. Conclusion: In this study, we evaluated NGS platforms for high resolution HLA typing. All kits were able to give HLA typing results as the same alleles with more than 99% accuracy. Differences in testing time, procedures and program analysis were found. However, the analysis for cost of reagents and number of samples tested are needed to be considered before HLA typing by NGS can be implemented in TSC