การพัฒนา in-house real-time polymerase chain reaction สำหรับการตรวจ HLA-B locus
Keywords:
HLA-B, Real-time PCRAbstract
บทคัดย่อ
บทนำ Human leukocyte antigen (HLA) มีความสำคัญในระบบภูมิคุ้มกัน โดยมีหน้าที่นำเสนอเปปไทด์ของแอนติเจนที่แปลกปลอมให้กับ T-cells ยีนHLA มีความหลากหลายในระบบภูมิคุ้มกัน โดยเฉพาะ HLA-B พบว่ามีความหลากหลายมากที่สุด ปัจจุบันมีการตรวจ HLA เพื่อดูยีนที่มีความสัมพันธ์กับการแพ้ยา กับการเกิดโรคบางชนิด และเพื่อการปลูกถ่ายอวัยวะ วิธี real-time polymerase chain reaction (PCR) เป็นวิธีที่นิยมมากขึ้นที่นำมาใช้ในการตรวจ HLA-typing เนื่องจากง่ายต่อการใช้งานและใช้เวลาในการตรวจสั้นกว่าวิธีอื่นๆ ซึ่งวิธีมาตรฐานที่ใช้ในปัจจุบันคือ PCR-sequence specific oligonucleotide (PCR-SSO), PCR-sequence-specific primer (PCR-SSP) และ real-time PCR วัตถุประสงค์ เพื่อพัฒนาชุดตรวจ HLA typing (HLA-B locus) โดยใช้ in-house real-time PCR สำหรับการตรวจในงานประจำและลดค่าใช้จ่ายในการซื้อชุดตรวจจากต่างประเทศ วัสดุและวิธีการ ตัวอย่างตรวจได้จากผู้บริจาคเกล็ดเลือด ที่ทราบผลตรวจ HLA-B แล้ว ในภาควิชาเวชศาสตร์การธนาคารเลือด คณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล มาทำการตรวจด้วยวิธี real-time PCR โดยเตรียม in-house primers ในการตรวจ HLA-B locus ทั้งหมด 22 คู่ โดยตรวจจำนวน 45 ตัวอย่าง และ B*15 ทั้งหมด 5 คู่ โดยตรวจจำนวน 10 ตัวอย่าง ผลการศึกษา การตรวจ HLA-B typing และ HLA-B*15 ด้วยวิธี real-time PCR โดยใช้ in-house primers พบว่าให้ผลบวกตรงตามวิธีที่ใช้ตรวจในงานประจำ สรุป การทำ in-house real-time PCR สำหรับตรวจ HLA B-locus ให้ผลตรวจถูกต้อง รวดเร็ว รวมระยะเวลาในการทำตั้งแต่เตรียมตัวอย่างจนถึงการอ่านผล น้อยกว่าวิธีที่ใช้ในปัจจุบัน รวมถึงต้นทุนต่อการทดสอบเมื่อเทียบกับชุดทดสอบของ real-time PCR จากต่างประเทศพบว่ามีต้นทุนที่ต่ำกว่าสามารถประหยัดค่าใช้จ่ายได้มาก
Abstract:
Introduction: The human leukocyte antigen (HLA) play an important role in the immune system by presenting peptides of the foreign antigen to the T-cells. HLA genes are diverse in population especially HLA-B which is the most polymorphic. HLA is currently being tested to look for genes that are associated with diseases, drug allergy and for organ transplantation. Currently, real-time polymerase chain reaction (PCR) technique has been more popular in HLA typing due to more convenience and less time consumption than the other techniques. The standard methods currently used are PCR-sequence specific oligonucleotide (PCR-SSO), PCR-sequence-specific primer (PCR-SSP), and real-time PCR. Objective: To develop HLA typing (HLA-B locus) assay using in-house real-time PCR for routine testing and reduce the cost of purchasing commercial kits. Materials and Methods: Platelet samples from the donors with known HLA-B types at the Department of Transfusion Medicine, Faculty of Medicine, Siriraj Hospital were typed by the developed in-house real-time PCR. A total of 45 samples were typed by 22 pairs of primers for HLA-B and 10 samples were typed by 5 pairs of primers for HLA-B*15. Results: Similar results were observed when the in-house real-time PCR assay for HLA-B and B*15 were compared to the routine methods. Conclusion: The developed in-house real-time PCR for typing of HLA-B is the useful technique with rapid and accurate results and costs less per test than the commercial real-time PCR kits.
Downloads
References
2. Bodis G, Toth V, Schwarting A. Role of Human Leukocyte Antigens (HLA) in Autoimmune Diseases. Methods Mol Biol. 2018;1802:11-29.
3. Mungall AJ, Palmer SA, Sims SK, Edwards CA, Ashurst JL, Wilming L, et al. The DNA sequence and analysis of human chromosome 6. Nature. 2003;425:805-11.
4. Leen G, Stein JE, Robinson J, Maldonado Torres H, Marsh SGE. The HLA diversity of the Anthony Nolan register. HLA. 2021;97:15-29.
5. Guillaume N. Improved flow cytometry crossmatching in kidney transplantation. HLA. 2018;92(6):375-83.
6. Tupmongkol T, Khanunthong S, Boonpokkrong P, Tatawatorn A, Nathalang O, Attajarusit Y ,et al. Implementation of Real-time PCR for HLA Typing in Deceased Donors. J Hematol Transfus Med. 2017;27:217-24.
7. Dunckley H. HLA typing by SSO and SSP methods. Methods Mol Biol. 2012;882:9-25.
8. Cao K, Chopek M, Fernández-Viña MA. High and intermediate resolution DNA typing systems for class I HLA-A, B, C genes by hybridization with sequence-specific oligonucleotide probes (SSOP). Rev Immunogenet. 1999;1:177-208.
9. Rahal M, Kervaire B, Villard J, Tiercy JM. DNA typing by microbead arrays and PCR-SSP: apparent false-negative or -positive hybridization or amplification signals disclose new HLA-B and -DRB1 alleles. Tissue Antigens. 2008;71:238-41.
10. Welsh K, Bunce M. Molecular typing for the MHC with PCR-SSP. Rev Immunogenet. 1999;1:157-76.
11. Navarro E, Serrano-Heras G, Castaño MJ, Solera J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 2015;439:231-50.
12. Cho EH, Lee SG, Seok JH, Park BY, Lee EH. Evaluation of two commercial HLA-B27 real-time PCR kits. Korean J Lab Med. 2009;29:589-93.
13. Nguyen DV, Vidal C, Chu HC, Do NT, Tran TT, Le HT, et al. Validation of a novel real-time PCR assay for detection of HLA-B*15:02 allele for prevention of carbamazepine - Induced Stevens-Johnson syndrome/Toxic epidermal necrolysis in individuals of Asian ancestry. Hum Immunol. 2016;77:1140-6.
14. Jaruthamsophon K, Sripo T, Sukasem C, Limprasert P. Comparison of a new in-house and three published HLA-B*15:02 screening methods for prevention of Carbamazepine-induced severe drug reactions. PloS one. 2016;11:e0155907.
15. Chen P, Lin JJ, Lu CS, Ong CT, Hsieh PF, Yang CC, et al. Carbamazepine-induced toxic effects and HLA-B*1502 screening in Taiwan. N Engl J Med. 2011;364:1126-33
16. Gierbolini J, Giarratano M, Benbadis SR. Carbamazepine-related antiepileptic drugs for the treatment of epilepsy - a comparative review. Expert Opin Pharmacother. 2016;17:885-8.
17. Liu Y, Yu Y, Nie X, Zhao L, Wang X. Association between HLA-B*15:02 and oxcarbazepine-induced cutaneous adverse reaction: a meta-analysis. Pharmacogenomics. 2018;19:547-52.
18. Barnardo MC, Welsh KI, Vilches C, Maitland K, Bunce M. Allele-specific HLA-B*15 typing by PCR-SSP and its application to four distinct ethnic populations. Tissue Antigens. 1998;51: 293–300.
