การวิเคราะห์ผลการตรวจชนิด เอชแอลเอ โดยวิธี Next-Generation Sequencing จากข้อมูลของการทดสอบความชํานาญที่โรงพยาบาลศิริราช

Abstract

บทคัดย่อ วิธีการตรวจหาแอนติเจนเม็ดเลือดขาว human leukocyte antigens (HLA) มีวิวัฒนาการ ตั้งแต่การตรวจโดยใช้วิธีทางซีโรโลยีและปัจจุบันใช้วิธีดีเอ็นเอในการตรวจ อย่างไรก็ตามการตรวจ HLA ยังมีข้อจำกัดในการแยกอัลลีลในระดับความละเอียดสูง จากความก้าวหน้าล่าสุดได้มีการนำเทคโนโลยีของ next-generation sequencing (NGS) มาใช้ในการตรวจหาลำดับเบสเพื่อใช้ในการตรวจหา HLA alleles ที่มีความละเอียดมากขึ้น วัตถุประสงค์ เพื่อประเมินผลการตรวจโดยใช้ เทคโนโลยีของ NGS (Roche Diagnostics, Indianapolis IN, USA) ซึ่งใช้ระบบของ GS Junior system โดยเปรียบเทียบผลการตรวจกับข้อมูลการตรวจ HLA จากการทดสอบความชำนาญ วัสดุและวิธีการ ใช้ตัวอย่างจำนวน 10 ตัวอย่างที่ได้จากการทดสอบความชำนาญซึ่งทราบผลการตรวจ HLA alleles ด้วยวิธี sequence-based typing (SBT) และ/หรือวิธี polymerase chain reaction-sequence specific primer (PCR-SSP) การศึกษาครั้งนี้ใช้เครื่อง GS Junior Sequencer (Roche Diagnostics, Indianapolis IN, USA) และใช้ โปรแกรม Conexio Genomics ASSIGN ATF 454 HLA genotyping ในการวิเคราะห์ข้อมูลของ HLA จำนวน 8 loci คือ HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 และ -DQB1 ผลการศึกษา จากการเปรียบเทียบพบว่าความสอดคล้องของผลการตรวจที่ได้ด้วยวิธี NGS กับผลการตรวจด้วยวิธี SBT และ PCR-SSP ที่ 98.33 % และวิธี NGS สามารถระบุความละเอียดได้ 4-6 ตำแหน่งของ HLA alleles ผลที่คลุมเครือ สามารถเกิดขึ้นได้ในบางตำแหน่ง HLA เพราะชุด primers ของระบบนี้จะไม่ครอบคลุมในบาง exons ของแต่ละ HLA loci สรุป การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า NGS สามารถสรุปผลการตรวจได้ชัดเจนขึ้นในบาง HLA loci และช่วยลดต้นทุนค่าใช้จ่ายในการตรวจ HLA alleles โดยเฉพาะในกรณีที่ทำการทดสอบครั้งละ 10 ตัวอย่างพร้อมกัน

Abstract: Method of identifying human leukocyte antigen (HLA) alleles has some evolved from serologically based methods to recently DNA-based methods.  However, HLA typing has some limitations to discriminate alleles at a high-resolution level.  Recent advances in next-generation sequencing (NGS) technologies have enabled NGS as a proven alternative technique for sequence-based typing for characterization of the HLA alleles.  Objective: To evaluate NGS of Roche Junior system (Roche Diagnostics, Indianapolis IN, USA) by comparing the results with data obtained from proficiency testing. Materials and methods: HLA genotyping was performed using NGS on 10 proficiency samples that had previously been HLA typed by SBT and/or PCR-SSP techniques.  The GS Junior Sequencer (Roche Diagnostics, Indianapolis IN, USA) with Conexio Genomics ASSIGN ATF 454 HLA genotyping software analysis was used to analyze sequence variations at eight HLA loci (HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 and -DQB1).  Results: The comparison of HLA typing results showed 98.33 % concordance between NGS versus PCR-SSP and SBT methods. Moreover, the data obtained by NGS could provide 4-6 digits of HLA alleles.  The genotyping ambiguities could still occur in some HLA loci because the primer sets of this system could not amplify in some exons.  Conclusion: NGS could reduce the genotyping ambiguities of some HLA loci and cost effective for HLA typing, especially in simultaneous testing of ten samples in a single run.