การตรวจลักษณะทางพันธุกรรมของหมู่เลือด ABO ด้วยวิธี Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism

บทคัดย่อ

บทคัดย่อ : หมู่เลือด ABO ถูกควบคุมด้วยยืน A, B และ O . B allele มีลำดับเบสนิวคลีโอไทด์แตกต่างจาก A allele ที่ตำแหน่ง 526(C-)G), 703(G A), 796(C->A) และ 803(G - X C) ทำให้การสร้างกรดอะมิโนเปลี่ยนแปลง allele แตกต่งจาก A และ B allele ที่ตำแหน่ง 261(G - /del) ทำให้เกิด frameshift และ premature stop codon  วัตถุประสงค์ : เพื่อตรวจ ABO genotype ด้วยวิธี polymerase chain reaction-restriction fragment length
polymorphism (PCR-RELP) วัสดุและวิธีการ : เก็บตัวอย่างเลือดผู้บริจาคโลหิตจำนวน 70 ราย โดยเลือกผู้บริจาคหมู่ A หมู่ B และหมู่ 0 อย่างละ 20 ราย และผู้บริจาคหมู่ AB 10 ราย ตรวจ ABO phenotype จาก clotted blood ด้วยวิธีมาตรฐานในหลอดทดลองโดยนำม็ดเลือดแดงมาทำปฎิกิริยากับ monoclonal anti-A1, anti-A, anti-B, anti-A,B และนำซีรัมมาทำปฎิกิริยากับ A1 cell และ B cell มาตรฐาน ตัวอย่างเลือด EDT'A blood ถูกนำมาสกัดดีเอ็นเอ ด้วยวิธี Chelex ตรวจแยกชนิด ABO alleles ด้วยวิธี PCR-RFLP โดยใช้ primer mo- 57/mo-46 เพิ่มขยายดีเอ็นเอในส่วน exon 6 และ ABO F624-649/A BOR770-798 เพิ่มขยายดีเอ็นเอในส่วน exon 7 นำ PCR product จาก mo 57mo-46 มาย่อยด้วย Kpn I ซึ่งมีความจำเพาะต่อ GGTAC /C เพื่อตรวจ O allele และ PCR product จาก ABO F624-649/A BOR770-798 มาย่อยด้วย Hpa II ซึ่งมีความจำเพาะต่อ C (CGG และเหรือ Alu I ซึ่งมีความจำเพาะต่อ AG CT เพื่อตรวจ B allele .ตรวจ cleavage product ด้วยการทำ electrophoresis บน 8.5% polyacrylamide gel. ทำ polymerase chain reaction-sequence specific primer (PCR-SSP) โดยใช้ primer 261XI 261C เพิ่มขยายดีเอ็นเอของ O allele ที่ตำแหน่ง 261(G-/del) ตรวจ PCR product ด้วย 2% agarose gel electrophoresis ผลการศึกษา : วิธี PCR-RFLP โดยใช้ primer mo -57/mo-46 และ Kpn I คนที่มี O allele Kpn
I ย่อยได้เป็น fragment ขนาด 87, 164 bp A หรือ B allele Kpn I ม่ย่อยเหลือ 252 bp เมื่อใช้ primer ABO F624 -649/ABOR770-798 และ Hpa II A หรือ O allele Hpa II ย่อยได้ 4 fragment คือ 78, 19, 24, 54 bp B allele มีตำแหน่ง 703(G 一JA) Hpa II ย่อยได้ 3 fragment คือ 97, 24, 54 bp แต่ fragment ขนาด 19, 24, 54 bp มีขนาดเล็กจึงตรวจไม่พบ เมื่อใช้ primer ABO F624-649/ABOR770-798 และย่อยด้วย Alu I คนที่มี B allele Al I ย่อยได้ 81, 94 bp A หรือ O allele Alu I ไม่ย่อยเหลือ 175 bp เมื่อนำ fragment ที่ย่อยได้จาก Kpn I มาแปลผลร่วมกับ Hpa I! หรือที่ย่อยได้จาก Kpn I แปลผลร่วมกับ Alu I สามารถแยกลักษณะทางพันธุกรรมได้ดังนี้ 1 genotype 00 Kpn I wu 87, 164 bp Hpa II พบ 78 bp Alu I wu 175 bp 2) genotype AA
Kpn I พบ 252 bp Hpa II พบ 78 bp . Alu I wบ 175 bp. 3) genotype BB Kpn I wu 252 bp ㆍ Hpa II พบ 97 bp Alu I พu 81, 94 bp 4) genotype AB Kpn I wu 252 bp. Hpa II wu 78, 97 bp Alu I พu 81, 94, 175 bp 5) genotype AO Kpn I พบ 87, 164, 252 bp Hpa II พu 78 bp Alu I พu 175 bp 6) genotype BO Kpn I wo 87, 164, 252 bp Hpa II พบ 78, 97 bp ㆍ Alu I wบ 81, 94, 175 bp การตรวจ PCR-SSP ถ้ามี O allele จะพบแถบดีเอ็นเอขนาด 195 bp ถ้าไม่มี O allele ไม่พบแถบดีเอ็นเอ การตรวจ ABO phenotype ด้วยวิธี serology ร่วมกับวิธี PCR-SSP สามารถแยกลักษณะทางพันธุกรรมเป็น O0, AA, BB, AB, AO, BO ได้เช่นกัน การตรวจ ABO phenotype 70 รายเป็นหมู่เลือด O 20 ราย, A 20 รายJ, B 18 ราย, AB 9 ราย, B weak
2 ราย แล .B 1 ราย การตรวจ PCR-RFLP และ PCR-SSP พบเป็น genotype O0 20 ราย, AA 3 ราย, AO 17 ราย, BB 6 ราย, BO 14 ราย และ AB 10 ราย โดย phenotype ที่ได้ B ทั้ง 2 รายมี genotype เป็น BO และ weak phenotype A weak B มี genotype เป็น AB สรุป : การตรวจ ABO genotype ด้วยวิธี PCR-RFLP 1) สามารถระบุลักษณะทางพันธุกรรมของหมู่เลือด AB0 ซึ่งผลที่ได้สอดคล้องกับการตรวจหายีน 0 ด้วยวิธี PCR -SSP ร่วมกับการตรวจ phenotype ด้วยวิธี serology 2) ABO genotype ที่ได้สอดคล้องกับลักษณะ ABO phenotype 3) วิธี PCR-RFLP อาจนำไปประยุกต์ใช้กับตัวอย่างดีเอ็นเอจากสิ่งส่งตรวจอื่น เช่น เนื้อเยื่อต่างๆ