Evaluation of the Three-Colored Flow Cytometric Crossmatch Assay in Living-Related Kidney Transplantation

Abstract

Abstract :

Introduction: Flow cytometric crossmatch (FCXM) is a cell-based assay for DSA detection. Validation and performance evaluation are essential. Objective: To optimize and validate the Siriraj three-colored FCXM protocol, and compare its performance with the two-colored FCXM protocol for living-related kidney transplantation. Materials and Methods: The three-colored FCXM were optimized and 30 donor lymphocyte samples were assayed with negative and positive control sera to determine cutoff values. Eighteen anti-HLA positive sera were assayed against donor lymphocytes with corresponding HLA antigens to determine accuracy. Twenty patients’ sera and their donor lymphocytes were crossmatched using CDC, AHG-CDC, two-colored FCXM and three-colored FCXM protocols in parallel to compare performance. Results: The cutoff values were median channel fluorescence shift (MCS) more than 22.46 channels for T cell FCXM and more than 52.78 channels for B cell FCXM. All results of three-colored FCXM assays performed on 18 pairs of donor cells versus sera with DSA were concordant with positive virtual crossmatches. Chi-square analysis showed association between the results of three-colored FCXM protocols and the results of two-colored FCXM protocols (T cell FCXM p < 0.05 and B cell FCXM p < 0.05). The three-colored FCXM protocol required less number of cells for analysis (1 x 10⁶ cells vs. 4 x 10⁶ cells), less number of test tube (5 tubes vs. 8 tubes), and less total assay time (250 mins vs. 360 mins) compared with the two-colored FCXM protocol. Conclusion: The optimized three-colored protocol were equivalent to the two-colored protocol for FCXM interpretation but less time and labor consumption.

บทคัดย่อ

 บทนำ   การทดสอบความเข้ากันได้ด้วยวิธีโฟลไซโตเมทรีสามสีเป็นการทดสอบโดยใช้เซลล์เพื่อหาแอนติบอดีที่จำเพาะกับผู้บริจาคในผู้ป่วยเตรียมรับการปลูกถ่ายอวัยวะ การประเมินความถูกต้องและความสามารถในการใช้งานก่อนนำมาใช้ในงานประจำเป็นสิ่งที่จำเป็น วัตถุประสงค์ เพื่อพัฒนาวิธีการในการทดสอบและประเมินความถูกต้องและความสามารถในการใช้งานของการทดสอบความเข้ากันได้ด้วยวิธีโฟลไซโตเมทรีสามสีเพื่อการปลูกถ่ายไตจากผู้บริจาคที่มีชีวิต วัสดุและวิธีการ หาค่าจุดตัดในการแปลผลโดยทดสอบซีรัมควบคุมผลลบและซีรัมควบคุมผลบวกกับเซลล์ของผู้บริจาคเลือดจำนวน 30 ราย ประเมินความถูกต้องโดยทดสอบซีรัมที่มีความจำเพาะกับแอนติเจนของผู้บริจาคเลือดจำนวน 18 ราย เปรียบเทียบความสามารถในการใช้งานของการทดสอบความเข้ากันได้ด้วยวิธีโฟลไซโตเมทรีโดยการย้อมทีและบีเซลล์สามสีและสองสีในผู้ป่วยที่จะได้รับการผ่าตัดปลูกถ่ายไตจากผู้บริจาคที่มีชีวิต  ผลการศึกษา ในการทดสอบความเข้ากันได้ด้วยวิธีโฟลไซโตเมทรีสามสีพบว่าค่าจุดตัดในการแปลผลคือ ผลการทดสอบที่ค่ามัธยฐานของการติดสีที่เบี่ยงเบนไปมากกว่าค่าของซีรัมควบคุมผลลบ จำนวน 22.46  ช่องสำหรับการทดสอบทีเซลล์และมากกว่า 52.78 ช่องสำหรับการทดสอบบีเซลล์ การประเมินความถูกต้องพบว่าการทดสอบความเข้ากันได้ด้วยวิธีโฟลไซโตเมทรีสามสีให้ผลบวกกับซีรั่มที่มีความจำเพาะกับแอนติเจนของผู้บริจาคเลือดทั้ง 18 ราย ผลการทดสอบความเข้ากันได้ด้วยวิธีโฟลไซโตเมทรีสามสีสัมพันธ์ไปกับผลการทดสอบความเข้ากันได้ด้วยวิธีโฟลไซโตเมทรีสองสี (การทดสอบทีเซลล์ p< 0.05 และการทดสอบบีเซลล์ p< 0.05) โดยใช้เซลล์น้อยกว่า (1 x10⁶ เซลล์กับ 4 x10⁶ เซลล์) หลอดทดลองน้อยกว่า (5 หลอดกับ  8 หลอด) และเวลาน้อยกว่า (250 นาทีกับ 360 นาที)  สรุป การทดสอบความเข้ากันได้ด้วยวิธีโฟลไซโตเมทรีสามสีที่พัฒนาขึ้นให้ผลการทดสอบสัมพันธ์ไปกับผลการทดสอบความเข้ากันได้ด้วยวิธีโฟลไซโตเมทรีสองสี โดยลดเวลาและแรงงานในการทำการทดสอบ