Markedly Different Expression in Mature Bovine Proacrosin Binding Protein (sp32)

Abstract

บทคัดย่อ

งานวิจัยนี้ทำการศึกษาโปรตีนในเซลล์อสุจิของโคโดยใช้เทคนิค 2-DE และ LC MS/MS และค้นพบประเด็นที่น่าสนใจ คือ การ แสดงออกของ proacrosin binding protein (sp32) ที่มีรูปแบบแตกต่างกัน จากการแยกโปรตีนของเซลล์อสุจิของพ่อโคพันธุ์บรามันห์ที่มี ความสมบูรณ์พันธุ์ จำนวน 9 ตัว ด้วยเทคนิค 2-DE และย้อมด้วยสี Coomassie brilliant blue พบจุดโปรตีนมากกว่า 600 จุด บนแผ่นเจล จากจุดโปรตีนทั้งหมดนี้ตรวจพบความแตกต่างของโปรตีนที่มีขนาด 32 กิโลดาลตัน ใน 2 รูปแบบ คือ รูปแบบ A และ B โดยรูปแบบ A มีการ แสดงออกของโปรตีนที่จุด Y₁ (ขนาด 32 กิโลดาลตัน และมีค่า pI เท่ากับ 5.3) ในปริมาณมาก ซึ่งตรวจพบในพ่อโคจำนวน 6 ตัว ส่วนรูปแบบ B มีการแสดงออกของโปรตีนที่จุด Y₁ (ขนาด 32 กิโลดาลตัน และมีค่า pI เท่ากับ 5.3) และ Y₂ (ขนาด 31.5 กิโลดาลตัน และมีค่า pI เท่ากับ 5.5) ในปริมาณน้อย ซึ่งตรวจพบในพ่อโคจำนวน 3 ตัว หลังจากทำการจำแนกชนิดโปรตีนด้วยเทคนิค LC MS/MS พบว่า โปรตีนจุด Y₁ และ Y₂ ทั้งในรูปแบบ A และ B คือ predicted (ได้มาจากการคำนวณจากลำดับเบสของจีน): proacrosin binding protein (sp32) ที่มีขนาด 62.3 กิโลดาลตันและมีค่า pI เท่ากับ 5.1 ใน Bos taurus โดยที่ลำดับกรดอะมิโนทั้งหมดของโปรตีนจุด Y₁ และ Y₂ ที่ได้จากการทำ LC MS/MS ตรงกันกับลำดับกรดอะมิโนในส่วนครึ่งปลายด้าน carboxyl-terminal ของโปรตีน sp32 จากผลการทดลองที่พบการแสดงออกของ โปรตีน sp32 ใน 2 รูปแบบ ทำให้มีศึกษาต่อเนื่องเพื่อตรวจสอบว่า โปรตีน sp32 ที่ปรากฏที่จุด Y₂ เป็นโปรตีนที่อยู่ในรูปแบบของ tyrosine phosphorylation (p32) เหมือนที่เคยมีรายงานไว้ในสุกรหรือไม่ ผลการทำอิมมูนโนบลอด และอิมมูนโนไซโตเคมีด้วยแอนติบอดี antiphosphotyrosine ไม่สามารถบอกได้ว่าจุดโปรตีน Y₂ คือ p32 จากการศึกษาครั้งนี้จึงสรุปได้ว่า การแยกโปรตีนในเซลล์อสุจิของโคด้วย เทคนิคทางโปรติโอมิกส์ สามารถระบุได้ว่าโปรตีน sp32 มีขนาด 32 กิโลดาลตัน และมีการแสดงออกที่แตกต่างกัน 2 รูปแบบ แม้ว่า การศึกษาครั้งนี้ไม่สามารถชี้ให้เห็นถึงโปรตีน sp32 ในรูปแบบของ p32 อย่างไรก็ตาม เป็นเรื่องน่าสนใจที่จะทำการศึกษาต่อไปว่า การ แสดงออกของโปรตีนที่แตกต่างกันนี้จะมีผลต่อการทำหน้าที่ของเซลล์อสุจิ และมีผลต่อการสืบพันธุ์ของพ่อโคอย่างไร

คำสำคัญ : โปรตีน, เซลล์อสุจิโค, 2-DE, LC MS/MS, sp32

Abstract

Our study investigated proteins in bovine spermatozoa using 2-DE and LC MS/MS and found a markedly different expression in mature bovine proacrosin binding protein (sp32), which is the focus of the present study. Spermatozoa extract from nine fertile Brahman bulls was separated using 2-DE followed by Coomassie brilliant blue staining. From over 600 protein spots, a particular protein spot with two different patterns was detected at 32 kDa. The high relative protein content of spot Y₁ (32 kDa pI 5.3, pattern A) was found in six bulls whereas the remaining three bulls expressed two small spots Y₁ and Y₂ (32 kDa pI 5.3 and 31.5 kDa pI 5.5, respectively; pattern B). Identification of spots Y₁ and Y₂ both in pattern A and B, by using LC MS/MS, revealed the predicted protein (derived from a genomic sequence)—the proacrosin binding protein, sp32 (62.3 kDa and pI 5.1) found in Bos taurus. The amino acid sequence coverage of these spots corresponded to the carboxyl-terminal half of sp32. Immunoblotting and immunocytochemistry with the anti-phosphotyrosine antibody were performed to determine whether the spot Y₂ was a tyrosine phosphorylated form (p32) of sp32 as reported on Sus scrofa. The results obtained did not confirm that Y₂ was a p32 form of sp32. In conclusion, we applied proteomic approaches to characterize bovine spermatozoa proteins and reported a mature bovine sp32, with a relative molecular mass of ~32 kDa. The markedly different expressions of sp32 were investigated for any post-translational modification, specifically phosphorylation; however, phosphotyrosine protein (p32) could not be confirmed. Further characterization and functional analysis are needed.

Keywords : bovine spermatozoa proteins, 2-DE, LC MS/MS, sp32