Modulating Neurogenesis in Embryoid Body Using a Selective TGF beta1/ALK Inhibitor Affects Gene Expression of Embryonic Stem Cell-derived Motor Neurons

Abstract

บทคัดย่อ

เซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนหนูเม้าส์เป็นต้นแบบที่มีประสิทธิภาพสำหรับการ วิเคราะห์กระบวนการทั้งระดับเซลล์และโมเลกุลของ การเกิดโรคทางระบบประสาท การพัฒนาการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ประสาทนำสั่ง เพื่อเพิ่มความเข้าใจ สามารถรักษาโรคทางระบบประสาท การศึกษานี้วิเคราะห์ผลของสารยับยั้ง TGF-β ที่จำเพาะกับตัวรับแบบที่ 1 ต่อประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์กลุ่มประสาทของ เซลล์ต้นกำเนิดหนูเม้าส์ เพื่อให้เป็นเซลล์ประสาทนำสั่ง เซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อน ถูกกระตุ้นให้เกาะตัวเป็นกลุ่มเซลล์เอ็มบริออยด์บอดี ใน น้ำยาเลี้ยงที่เสริมด้วยกรดเรติโนอิก (retinoic acid) โดยใช้วิธีการ -4/+4 จากนั้นเอ็มบริออยด์บอดีอายุ 8 วันจึงถูกเหนี่ยวนำ เพื่อให้ เปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ประสาทนำสั่งด้วยการเลี้ยงในจานเพาะแบบเซลล์ชั้น เดียว ผลเซลล์ต้นกำเนิดที่เกาะกลุ่มกันเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ ต้นตอประสาทและเซลล์ประสาท จากการตรวจยืนยันด้วย Pax-6 และ Tuj-1 จากการวิเคราะห์ด้วย Quantitative RT-PCR พบว่าการเลี้ยง เอ็มบริออยด์บอดีด้วยสารยับยั้งจำเพาะ TGF- β1 เพิ่มระดับจีนที่จำเพาะต่อเซลล์ต้นตอประสาทนำสั่ง (Olig2) สูงกว่ากลุ่มควบคุม (4.20±0.20 เทียบกับ 0.73±0.09, p < 0.01) ในทางตรงกันข้ามระดับการแสดงออกของ mRNA ที่จำเพาะต่อเซลล์ประสาทนำสั่ง (Hoxc8) ของกลุ่มควบคุมสูงกว่ากลุ่มที่ใส่สารยับยั้ง TGF- β1 อย่างมีนัยสำคัญ (14.73±2.6 เทียบกับ 2.37±0.42, p < 0.01) อิมมูนโนไซโตเคมีแสดง ให้เห็นว่าเซลล์ที่เปลี่ยนแปลงมีการแสดงออกของโปรตีน ตัวบ่งชี้เซลล์ประสาท (Tuj-1) เซลล์ต้นตอประสาทนำสั่ง (Olig2) และเซลล์ประสาท นำสั่งที่กำลังพัฒนา (Isl-1) ซึ่งทั้งหมดจำเป็นต่อการสร้างเซลล์ประสาทนำสั่งไขสันหลังในช่วงการก่อตัวของ ท่อประสาท ยิ่งไปกว่านั้นเซลล์ที่ เปลี่ยนแปลงจำนวนหนึ่งยังแสดงผลบวกต่อ choline acetyltransferase (ChAT) ซึ่งบ่งชี้การทำงานของเซลล์ประสาทนำสั่ง จ า ก ก า ร ทดลองสรุปได้ว่าการปรับเปลี่ยนสัญญาณของ TGF-β ส่งผลต่อการสร้างและเปลี่ยนแปลงของเซลล์ต้นตอประสาทนำสั่ง

คำสำคัญ : เอ็มบริออยด์บอดี, เซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อน, การเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ประสาทนำสั่ง, สารยับยั้ง TGF- β1

Abstract

Mouse embryonic stem (ES) cells have been served as potential model for investigation of underlying mechanisms at cellular and molecular levels of neurological disorders. The improvement of motor neuron differentiation is prospected to gain more understanding aimed at overcoming several incurable motor neuron diseases. In this study, we examined the effects of selective inhibitor of TGF-β type I receptor on the efficacy of neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells toward motor neuron. Pluripotent ES cells were induced to form as EB in suspension medium supplemented with retinoic acid using -4/+4 protocol. Thereafter, 8-day old EBs were further induced to differentiate into motor neurons on monolayer culture. Our result demonstrated that the aggregated ES cells differentiated into neuronal progenitor cells and neurons as examined with Pax-6 and Tuj-1. Quantitative RT-PCR analysis revealed that treatment of the EBs with selective TGF-β1 inhibitor up-regulated the motor neuron progenitor (Olig2) at higher levels than that obtained from the control (4.20±0.20 vs. 0.73±0.09, p < 0.01). In contrast, mRNA expression levels of motor neuron (Hoxc8) of the control group were significantly higher than the TGF-β1 inhibitor treated group (14.73±2.6 vs. 2.37±0.42, p < 0.01). Immunocytochemistry demonstrated that the differentiated cells expressed a neuronal marker (Tuj-1), motor neuron progenitor marker (Olig2) and developing motor neuron progenitor (Isl-1), all of which are essential for generation of spinal motor neurons during neural tube formation. Furthermore, a small proportion of differentiated cells were also positive for choline acetyltransferase (ChAT) a marker for functional motor neurons. We concluded that modifying TGF-β signaling affected the generation and differentiation fate of motor neuron progenitor cells.

Keywords : embryoid body, embryonic stem cells, motor neuron differentiation, TGF-β1 inhibitor