Cloning and Prokaryotic Expression of cDNAs from Hepatitis E Virus Structural Gene of the SW189 Strain
Keywords:
โคลนนิ่ง, ไวรัสตับอักเสบ อี, การแสดงออกในเซลล์โปรคาริโอต, western blot, cloning, hepatitis E virus, prokaryotic expressionAbstract
บทคัดย่อ
การศึกษา ORF2 และคุณลักษณะของสายเปปไทด์แอนติเจนของจีโนไทป์ที่ 4 ของเชื้อไวรัสตับอักเสบอี (HEV) มีความจำเป็นที่ต้องศึกษาเพื่อการพัฒนาชุดตรวจสอบสำเร็จรูปที่มีความไวและความจำเพาะต่อแอนติบอดี้ชนิด IgM ของ HEV วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้เพื่อสร้างรีคอมบิแนนท์แอนติเจน เพื่อนำไปพัฒนาชุดตรวจอีไลซา และวัคซีนป้องกันโรคไวรัสตับอักเสบ อี โดยทำการสกัดสาย cDNA ขนาด 728 เบส จากส่วน 5' ของORF2 ของ HEV ที่แยกได้จากมณฑลกานซู ภาคตะวันตกของจีน นำชิ้นส่วนดีเอ็นเอมาย่อยด้วยเอนไซม์ Not Iและ NCO I และนำไปใส่ในเวกเตอร์ pET32a(+) จากนั้นนำพลาสมิดที่ผ่านการตัดต่อใส่ใน E. coli Rosetta และทำการตรวจสอบโปรตีนลูกผสมด้วยวิธี Western blot จากนั้นนำพลาสมิดที่ผ่านการตัดต่อมาตรวจสอบโดยการสกัด แล้วทำการย่อยด้วยเอนไซม์ ตามด้วยปฏิกิริยาพีซีอาร์ และวิเคราะห์ลำดับคู่เบสตามลำดับ พบว่าการแยกโปรตีนด้วยไฟฟ้า ได้โปรตีนขนาด 45.3 kDa และเมื่อวิเคราะห์โดยวิธี Western blot โปรตีนดังกล่าวทำปฏิกิริยากับซีรั่มที่มีแอนติบอดี้ต่อ HEV ที่ความเข้มข้น 1:1500 ชี้ให้เห็นว่าโปรตีนรีคอมบิแนนท์ pORF2 สามารถนำมาใช้ในการพัฒนาชุดตรวจอีไลซา และวัคซีนป้องกันโรคไวรัสตับอักเสบ อี ต่อไปได้
คำสำคัญ : โคลนนิ่ง, ไวรัสตับอักเสบ อี, การแสดงออกในเซลล์โปรคาริโอต, western blot
Abstract
It is necessary to study the second open reading frame (open reading frame 2, ORF2) and antigenic peptidescharacteristic of genotype 4 of HEV, and create one kind of high sensitivity and specificity of anti-HEV IgM detectionkit. The objective of this study was to obtain recombinant antigen for development of anti-HEV ELISA method andvaccine against hepatitis E virus infection. A 728 base cDNA was collected from 5'-terminus of open reading frame 2(ORF2) among epidemic hepatitis E virus (HEV) isolated from Gansu, Western China. The fragment was digestedwith Not I and Nco I, and inserted into vector pET32a(+). The recombinant plasmid was transformed into E. coliRosetta and the fusion protein expressed was confirmed by Western blot analysis. The recombinant plasmid wasidentified and confirmed with enzyme digestion, polymerase chain reaction (PCR) and sequencing, respectively. Aprotein band of about 45.3 kDa was demonstrated by SDS-PAGE. The result of Western blot analysis suggested thatthe fusion protein reacted with anti-HEV positive sera at a dilution of 1:1500. The recombinant protein pORF2 may beuseful in developing anti-HEV ELISA kit and vaccine against hepatitis E virus infection.
Keywords : cloning, hepatitis E virus, prokaryotic expression, western blot
