Duplex PCR for Simultaneous and Unambiguous Detection of Streptococcus iniae and Streptococcus agalactiae associated with Streptococcosis of Cultured Tilapia in Thailand

Abstract

บทคัดย่อ

โรคสเตรปโตคอคโคซิสซึ่งพบในปลานิลเพาะเลี้ยงในประเทศไทย เกิดจากการติดเชื้อ สเตรปโตคอคคัส อินิเอ้และสเตรปโตคอคคัสอกาแลคติเอ้ การวินิจฉัยแยกแยะระหว่างเชื้อทั้งสองชนิดนี้ทำได้ยากในทางปฏิบัติเนื่องจากอาการป่วยของปลาที่ติดเชื้อรวมทั้งผลการทดสอบทางชีวเคมีนั้นมีความคล้ายคลึงกันมาก ด้วยเหตุนี้คณะผู้วิจัยจึงได้พัฒนาวิธีการตรวจวินิจฉัยด้วยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรสแบบดูเพล็กซ์ขึ้น ซึ่งเทคนิคดังกล่าวอาศัยการเพิ่มปริมาณของยีนแลคเตทออกซิเดส (lctO) และไรโบโซม (16s rRNA) ซึ่งจำเพาะกับเชื้อ สเตรปโตคอคคัส อินิเอ้และสเตรปโตคอคคัส อกาแลคติเอ้ ตามลำดับ จากผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าความจำเพาะในการตรวจสูงถึง 100 % และสามารถตรวจวินิจฉัยแม้มีดีเอ็นเอปริมาณเพียง 100 fg สำหรับปริมาณเชื้อต่ำที่ปนเปื้อนในตัวอย่างที่น้อยสุดเท่าที่จะสามารถตรวจพบได้ในตัวอย่างชิ้นเนื้อ คือ 10⁶ เซลล์ของเชื้อต่อตัวอย่างหนึ่งกรัม จากผลการทดลองทั้งหมดแสดงให้เห็นว่าเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบดูเพล็กซ์นั้นเป็นวิธีการวินิจฉัยที่ทำได้ง่าย รวดเร็ว มีความไวและความจำเพาะสูง เหมาะสำหรับนำมาประยุกต์ใช้ในการตรวจหาสาเหตุของโรคสเตรปโตคอคโคซิสที่พบในปลานิลเพาะเลี้ยงในประเทศไทย

คำสำคัญ : ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรสแบบดูเพล็กซ์, สเตรปโตคอคคัส, อินิเอ้, สเตรปโตคอคคัส, อกาแลคติเอ้, ปลานิล

Abstract

Warm-water streptococcosis outbreaks in Thai cultured tilapia are caused by Streptococcus iniae and S.agalactiae. However, distinguishing between these two species of streptococcus are very difficult due to their similarmicrobiological appearance and clinical signs of infected fish. In this study, we proposed a new duplex-PCR basedmethod for simultaneous detection of these pathogens. The duplex-PCR amplified partial lctO and 16s rRNA gene ofS. iniae and S. agalactiae at 870 bp and 220 bp, respectively. This technique gave 100% specificity while sensitivity ofreaction was 100 fg of each bacterial genomic DNA. Detection limit of duplex-PCR applicable to clinical specimens isalso evaluated as 106 bacterial cells per gram of fish tissue. This study suggested that this duplex-PCR based methodmight be a good candidate for easy, sensitive, specific and rapid detection of S. iniae and S. agalactiae associated withwarm-water streptococcosis of cultured tilapia in Thailand.

Keywords : duplex PCR, Streptococcus iniae, Streptococcus agalactiae, Tilapia