Assessment of Appropriate L-cysteine Concentration for Boar Semen Cryopreservation by Using Flow Cytometry

Abstract

บทคัดย่อ

การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจหาความเข้มข้นที่เหมาะสมของแอลซีสเตอีนเติมลงในสารละลายเจือจางน้ำเชื้อ lactose-egg yolk (LEY) เพื่อปรับปรุงคุณภาพของน้ำเชื้อสุกรพ่อพันธุ์ภายหลังการแช่แข็งและทำละลายโดยใช้วิธีย้อม Annexin-V/PI ร่วมกับโฟลว์ไซโตเม เตอร์ น้ำเชื้อสดจากสุกรพ่อพันธุ์จำนวน 12 ตัวผ่านกระบวนการโดยใช้สารละลายเจือจางน้ำเชื้อ LEY และเติมแอลซีสเตอีนที่ความเข้มข้น 0 5 10 และ 15 มิลลิโมลาร์ น้ำเชื้อตัวอย่างนำไปผ่านการแช่แข็งและทำละลายก่อนนำไปศึกษา ลักษณะผิวของเยื่อหุ้มเซลล์อสุจิศึกษาด้วย กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (SEM) ขณะที่ความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์อสุจิศึกษาด้วยวิธีย้อม Annexin-V/PI ผลจากกล้อง SEM พบความเสียหายแบบต่างๆ เกิดขึ้นกับผิวของเยื่อหุ้มเซลล์อสุจิในทุกความเข้มข้น ขณะที่ยังพบเซลล์อสุจิที่มีเยื่อหุ้มเซลล์สมบูรณ์ กระจายอยู่ เมื่อศึกษาด้วยการย้อม Annexin-V/PI พบว่า เซลล์อสุจิที่มีเยื่อหุ้มสมบูรณ์ซึ่งมีชีวิตและไม่มีการเสื่อมตาย (AN-/PI-) เพิ่มขึ้น (p< 0.05) ที่ความเข้มข้น 5 และ 10 มิลลิโมลาร์ การศึกษานี้บ่งชี้ว่า ความเสียหายของเยื่อหุ้มเซลล์อสุจิสามารถพบได้ในน้ำเชื้อที่ผ่านการแช่แข็ง และทำละลาย นอกจากนี้ พบว่าแอลซีสเตอีนที่ความเข้มข้น 5 และ 10 มิลลิโมลาร์ใน LEY เป็นความเข้มข้นที่เหมาะสม มีผลต่อต้านภาวะ oxidative stress ซึ่งช่วยให้น้ำเชื้อสุกรพ่อพันธุ์แช่แข็งมีคุณภาพดีขึ้น

คำสำคัญ : การแช่แข็ง, แอลซีสเตอีน, สุกร, สารละลายเจือจางน้ำเชื้อ, เซลล์อสุจิ

Abstract

The present study aims to investigate a suitable L-cysteine level to be added the lactose-egg yolk (LEY) extender to improve the quality of boar semen after freezing-thawing using Annexin-V and propidium iodide (PI) assay detected with flow cytometer. Ejaculates from twelve boars were processed in the LEY extender and added with 0, 5, 10 and 15 mM of L-cysteine. Semen suspensions were cryopreserved with a controlled-rate freezer and thawed for examination. The surface of sperm plasma membrane was explored by scanning electron microscopy (SEM) while sperm membrane integrity was performed by Annexin-V/PI assay. Of all treatments, the damaged spermatozoa in various patterns were observed whereas the intact spermatozoa were still found by SEM. The viable and non-apoptotic (AN-/PI-) sperms were higher (p< 0.05) in the levels of 5 and 10 mM. These results indicated that the damaged spermatozoa were found after freezing/thawing and the L-cysteine at concentrations of 5 to 10 mM added to LEY extender was the optimal dose against oxidative stress and acquisition for improving cryopreserved boar sperm quality.

Keywords : freezing, L-cysteine, pig, semen extender, spermatozoa